导语
组织驻留巨噬细胞（TRM）和树突状细胞（DC）具有高度异质性，对免疫、组织再生和稳态维持至关重要。本文通过单细胞 RNA 测序全面分析了成年斑马鱼器官中 TRM 和 DC 的异质性。鉴定了两个巨噬细胞亚群：在屏障组织、肝脏和心脏中具有组织再生特征的促炎性巨噬细胞和具有组织再生特征的促炎性巨噬细胞。同时，在这些器官中还观察到一种具有突出抗原呈递能力的常规树突状细胞（cDC）群体和具有抗病毒特性的浆细胞样树突状细胞（pDC）。值得注意的是，除了具有强大吞噬能力的单个巨噬细胞 / 小胶质细胞群外，在大脑中还鉴定出一个 pDC 细胞群和两个不同的 cDC 群。本研究描绘了 TRM 和 DC 的景观，并为深入研究斑马鱼中的这些细胞创造了有价值的工具。
技术方法
ScRNA-Seq
研究结果
1. scRNA-seq 揭示了成年斑马鱼中不同的 mpeg1.1+ 免疫细胞类型
从 6 个月大的 Tg（mpeg1.1:DsRedx）鱼的六个不同器官（包括三个屏障组织（表皮、鳃、肠）和三个内脏（肝脏、心脏和大脑）中分离出来的 mpeg1.1+ 细胞（一种被广泛使用的髓系报告细胞系）进行了基于液滴的 scRNA-seq（图 1A）。在严格的质量控制过滤和进一步排除受污染的 mpeg1.1- 细胞后，研究者分别对每个器官中的高质量 mpeg1.1+ 细胞进行无监督聚类，研究的 scRNA-seq 数据显示，Tg（mpeg1.1:DsRedx）报告基因标记了八个不同的细胞群，包括三个单核髓细胞群（巨噬细胞、DC 和中性细胞）、两种淋巴细胞类型（B 和 NK 样 [NKL]）和一个 il6r+ 群，以及翻译和循环簇。由于翻译和循环簇可能代表巨噬细胞和树突状细胞的特定发育阶段或功能状态，研究者在此专门关注其他六个细胞群。
2. mpeg1.1+ 免疫细胞群在器官中高度保守
通过组合来自所有器官的 mpeg1.1+ 群进行比较分析，评估了同一细胞群在不同器官之间的转录相似性。Pearson 相关分析显示，来自不同器官的相同细胞群通常高度相关（图 2A）。这些群体的总体跨器官相似性表明，每个细胞群都有一个核心转录组特征，该特征定义了其身份，并赋予了跨器官的特殊功能，并揭示了可能参与其发育的谱系特异性 TFs。
3. 屏障组织、肝脏和心脏中两种不同功能的巨噬细胞亚群
从所有器官中提取了巨噬细胞群体，并以更高的分辨率重新聚集（图 3A）。由于脑内的巨噬细胞——小胶质细胞，与屏障组织、肝脏和心脏中的巨噬细胞表现出相对不同的转录组特征（图 2A），分别讨论了外周巨噬细胞和小胶质细胞。聚类显示了两种不同的巨噬细胞亚群，lgals3bpb+ 巨噬细胞和 ccl34a.4+ 巨噬细胞，在屏障组织、肝脏和心脏中具有不同的分布模式（图 3A–3C），对这两个吞噬细胞亚群之间的 DEGs 进行了基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果显示 lgals3bpb+ 巨噬细胞表现出促炎作用，具有较强的吞噬作用和免疫细胞募集能力。另一方面，ccl34a.4+ 巨噬细胞最突出的特征是它们广泛表达与组织重塑和再生有关的基因，包括与细胞生长和增殖（例如 igf2b 和 hBegfa）、细胞外间质重塑（例如 timp2b、timp4.3 和 tgfbi）、伤口愈合（例如 plecb 和 f13a1b）和免疫调节（例如 cfp、ccl34a.4 和 ccl38.1）（图 3D 和 3F）
4. 斑马鱼中的 cDCs 和 pDCs
为了更好地了解斑马鱼 DCs 的异质性、分布、个体发育和功能，作者从每个器官中提取了 DC 群体，并重新进行了聚类分析。与哺乳动物一样，斑马鱼包含两个主要的 DC 群：具有与抗原呈递相关基因的 cDCs（例如 mhc2dab、cd74a）和基于其内源性 TLRs 的独特表达而定义的 pDCs（tlr7.1 和 tlr9）在屏障组织、肝脏和心脏中，检测到一个主要的 cDC 群，斑马鱼 cDCs 可能作为抗原呈递细胞发挥作用，并可能发挥重要的免疫调节作用。另一方面，斑马鱼的 pDCs 显著高表达组织蛋白酶 Bb（ctsbb）和嘌呤受体蛋白 P2X 3a（p2rx3a）（图 4B）。除了内源性 TLRs tlr7.1 和 tlr9（图 4D 和 S2B）的独特表达外，哺乳动物 pDCs 的特征基因也富集于控制 I 型干扰素产生的干扰素调节因子（例如 irf3 和 irf7）（图 4D 和 4E），表明它们在抗病毒应答中的专门作用，这是哺乳动物 pDCs 的显著功能。与只有一个 cDC 群的屏障组织、肝脏和心脏不同，大脑具有两个不同的转录 cDC 亚群，cnn3a+cDCs 和 ccl35+cDCs，各类富集分析表明，成年斑马鱼大脑中含有吞噬小胶质细胞和调节性 DCs，它们具有深刻的脑特异性特征，并在中枢神经系统中发挥特殊功能。
5. 为巨噬细胞和 DC 亚群生成特异性报告细胞系
通过鉴定成年斑马鱼中不同的巨噬细胞和 DC 亚群，接下来试图产生特定的报告细胞系，用于这些细胞发育和功能的进一步研究。选择两个分别在器官和所有 TRMs 的 cDC 群中高表达的基因 ccl35.1 和 c1qb 作为常见的 cDC 和泛巨噬细胞标记。此外，选择分别在促炎性巨噬细胞和促重塑巨噬细胞中明确表达的 lgals3bpb 和 ccl34a.4 作为巨噬细胞子集特异性标记。基于这些基因的荧光报告系是通过克隆其启动子或利用其细菌人工染色体（BAC）载体来创建的。结果，获得了四个报告系，TgBAC（ccl35.1:EGFP）、Tg（c1qb:EGFP）、Tg（lgals3bpb:EGFP）和 TgBAC（ccl34a.4:EGFP），其可能分别标记常见的 cDCs、泛巨噬细胞、促炎巨噬细胞和促重塑巨噬细胞（图 6A-6D）。这些报告基因系忠实地再现了标记基因的内源性表达，并特异性标记了指定的巨噬细胞或 DC 亚群，为研究这些不同髓系群的发育和功能提供了有力的工具。
总结
在这项研究中，作者利用 scRNA-seq 来破译成年斑马鱼中 TRM 和 DC 的异质性，在器官中鉴定了各种功能保守的 TRM 和 DC 亚群，并根据这些不同亚群的区分标记生成了几种巨噬细胞和 DC 特异性报告系。该研究增强了对斑马鱼中 TRM 和 DC 的理解，并为这些细胞的进一步发育和功能表征提供了有价值的工具。
参考文献：
Zhou Q, Zhao C, Yang Z, Qu R, Li Y, Fan Y, Tang J, Xie T, Wen Z. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023 Jul 25;42(7):112793. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112793. Epub 2023 Jul 14. PMID: 37453064.
