病毒性神经坏死是一种广泛存在于海洋水产养殖的疾病，主要影响海鱼，并对养殖业造成重大损失。这种疾病是由神经坏死病毒（nervous necrosis virus, NNV）引起的，它是一种分节段的正链 RNA 病毒，属于野田病毒科（Nodaviridae）。NNV 是世界范围内养殖鱼类最重要的威肋之一，近年来受感染的鱼类种类、数量和损害程度都迅速增加。NNVs 直径约 25-30 nm，为二十面体结构，无包膜，基因组由 2 段正链 RNA 组成。RNA1 编码 RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RdRp)和非结构蛋白 B，RNA2 编码衣壳蛋白（CP)。
图 1. NNV 结构示意图
NNV 主要感染鱼类的中枢神经系统和视网膜神经系统，可造成 50 多种海洋和淡水硬骨鱼的幼虫和幼鱼种群大量死亡，感染后 1 周内死亡率可达 100%。到目前为止，四种不同的 NNV 物种已经被国际病毒分类委员会正式认定：赤点石斑神经坏死病毒（RGNNV）、拟鲹神经坏死病毒（SJNNV）、条斑星鲽神经坏死病毒（BFNNV）和红鳍东方鲀神经坏死病毒（TPNNV）。其中 RGNNV 传播最为广泛，感染这种病毒的鱼表现出临床症状，包括有不同程度的神经异常行为（如不正常游动、丧失平衡能力、做螺旋或翻圈泳姿，静止时腹部朝上）和体色变深等。RGNNV 不仅感染石斑鱼，还感染许多其它经济价值较高的海洋鱼类，包括欧洲鲈（Dicentrarchus labrax) 和日本真鲈（Lateolabrax japonicus)。
图 2. NNV 衣壳蛋白系统发育分析
目前，还没有有效治疗这些 NNVs 引起的疾病的方法。不过，如果能及早发现病毒，就可以采取有效措施，减少病毒对健康养殖鱼类的伤害。因此，为了实现可用于及时止损的的养殖场检测策略，建议在水产养殖期间使用分子检测方法定期监测，以确保鱼类不受 RGNNV 感染。因此，开发一种快速、高灵敏度的检测 NNVs 的方法对于疾病预防和控制至关重要。
01、基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 检测原理
华南农业大学海洋科学学院王庆课题组开发了一种基于 CRISPR/Cas13a 系统快速检测赤点石斑神经坏死病毒（RGNNV)的方法，该方法具有高灵敏度和高特异性，为 RGNNV 的即时现场检测提供了新方案。
整个检测过程如下，将 Cas13a 和 crRNA 进行共孵育形成 Cas13a/crRNA 复合物，该复合物可以特异性的识别 RGNNV 靶标核酸。当靶标被 crRNA 特异性识别后，Cas13a 的反式切割活性被激活，开始切割 RNA 报告探针，发出检测信号。
图 3. 基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 检测原理
02、CRISPR/Cas13a 检测靶标 RNA 的可行性分析
CRISPR/Cas13a 系统依靠 crRNA 和 Cas13a 进行核酸检测，通过增加或减少相关组分来验证该检测系统有效靶向 RGNNV 的可行性。结果表明，只有当检测系统中所有组分都完整时，才会检测到显著的荧光信号。Cas13a 在 crRNA 引导下准确靶向到目标序列后，Cas13a 被激活并反式剪切 RNA 报告探针，发出荧光信号。
图 4. CRISPR 系统检测靶标 RNA 的可行性分析
03、CRISPR/Cas13a 检测体系条件优化
将 RNA 标准品和未扩增的样本 RNA 分开检测，测试发现，crRNA-CP 始终比 crRNA-RdRp 具有更高的检测灵敏度。因此，使用 crRNA-CP 进行后续检测。为了评估反应温度对检测系统的影响，测试了 25℃、37℃和 45℃。反应速度随温度升高而增加，45℃组荧光值达到平台仅需 1 分钟，37℃组需 5 分钟，25℃组需 15 分钟以上。37℃组的荧光信号比其他两组更强，因此 37℃为最佳反应温度。接下来，测试了 RNA 报告探针浓度对检测信号的影响，结果表明，探针浓度在 500～700 nM 范围内检测效果最好。最后，发现当 Cas 蛋白与 crRNA 的分子比为 4:1、3:1 时，Cas13a 表现出饱和活性。通过调整分析系统中 Cas 蛋白与 crRNA 的浓度来找到最佳比例。当 Cas13a 的浓度一定时，更多的 crRNA 并没有增加荧光信号。相比之下，当使用 Cas 蛋白与 crRNA 的浓度比例为 1:2 时获得最高的检测信号。Cas 蛋白与 crRNA 的浓度比例为 1:3 时，荧光信号开始减少。这些结果强调了适当的 Cas 蛋白和 crRNA 浓度在检测中的重要性。
图 5. CRISPR/Cas13a 检测体系条件优化
04、检测灵敏度评估
为了测试基于 CRISPR/Cas13a 检测 RGNNV 的灵敏度，将 RGNNV 标准品 RNA 进行梯度稀释，使用新构建的方法进行检测。加入目标 RNA 后，荧光信号发生了显著变化。经过优化的检测系统可以检测到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。检测仪器荧光采集结果显示，当靶 RNA 浓度低于 102 fM 时，测得的荧光信号强度与空白对照无显著差异；当浓度大于 102 fM 时，可以检测到明显的荧光信号。因此，优化后的检测系统可以检测到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。
图 6. 检测 RGNNV 的灵敏度测试
05、检测特异性评估
为了评估该检测方法的特异性，使用同一系统检测了 RGNNV、BFNNV 和 TPNNV 这三种病毒。BFNNV 的荧光信号强度与阴性对照没有差异，但 TPNNV 引起了轻微的荧光信号（P<0.0001)，突出了该检测系统对其预期靶标 RGNNV 的较高特异性。
图 7. RGNNV 病毒检测系统的特异性
06、各地区鱼群样本的检测
从国内不同地区收集的感染 RGNNV 的幼鱼样本进行了病毒 RNA 预处理和预扩增，然后与阴性对照进行测试，结果与 qPCR 结果一致（18
图 8. 各地区鱼群样本检测数据
总结
本研究建立了一种基于 CRISPR/Cas13a 系统的 RGNNV 快速检测方法。RGNNV 的最佳检测系统包含 120 nM Cas13a、250 nM crRNA 和 600 nM RNA 报告探针，反应体系在 37℃下孵育提高了切割效果。该方法特异性强、灵敏度高、重现性好、准确度高，可以使用便携式紫外灯或荧光检测仪器进行检测，比传统检测方法更具时效性、便捷性和简单性，具有较高的应用推广前景。
参考文献：
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