项目文章 | 在血糖水平变化的情况下，达格列净可通过不同方式减轻肾脏炎症并预防糖尿病肾病

原创 shbio 伯豪生物

2023年11月20日 09:14

期刊：Frontiers in Immunology

影响因子：7.3

伯豪技术服务：mRNA测序；ATAC测序

导读

随着糖尿病发病率的不断增加，糖尿病肾病（DKD）已成为世界范围内终末期肾病（ESRD）的主要原因，加重了约1/2的2型糖尿病患者和1/3的1型糖尿病患者的负担。DKD患者在最终发生ESRD前进行性蛋白尿和肾小球滤过率下降。抑制肾近端肾小管细胞中的钠-葡萄糖共转运体2（SGLT2）是一种有效的降血糖策略，它也有利于糖尿病患者的肾脏和心血管功能。达格列净是一种很有前途的SGLT2抑制剂，具有广泛的临床应用前景，可通过降糖、减肥、降血压等方式使患者受益。从长期来看，达格列净已被证明可以维持肾小球滤过率，并降低DKD或非糖尿病慢性肾病（CKD）患者发生ESRD和肾脏相关或心血管死亡的风险。目前对SGLT2抑制剂的肾保护作用的机制的理解主要集中在肾微血管血流动力学和肾内在细胞代谢上，而这种治疗如何调节肾脏炎症仍在很大程度上不清楚。

研究技术

mRNA测序；ATAC测序

（伯豪生物提供技术服务）

研究结果

1.达格列净可减轻2型糖尿病小鼠体内的高血糖和肾脏损伤

糖尿病模型转基因小鼠14周龄显示自发2型糖尿病表型；与健康小鼠相比，糖尿病小鼠体重增加和高血糖升高（图1A、B）。对于肾功能检测结果显示，糖尿病小鼠血清肌酐水平升高，尿白蛋白肌酐水平升高（图1C-E）。肾组织schiff染色显示轻中度糖尿病肾结构改变，包括系膜面积增宽、系膜基质增加和系膜增生，而这些变化在接受达格列净治疗的小鼠中得到减轻（图1F）。

图1

2. 结合ATAC和RNA测序揭示了糖尿病肾病的潜在候选基因

为了确定可能参与DKD发病机制的潜在候选基因，我们对小鼠全肾裂解物进行了RNA测序和转座酶可及染色质高通量测序（ATAC-seq）分析的联合分析。测序结果热图(图2A)、利用GO和KEGG数据库进行功能富集分析表明，除了代谢紊乱外，糖尿病小鼠还表现出涉及干扰素反应的免疫系统改变（图2B-D）。ATAC热图（图2E），同样，这两组的top DEGs在免疫相关途径中富集，特别是对干扰素的反应（图2F-H）。K-means分析揭示了Ctrl组和糖尿病组之间的一致性。根据三组间表达模式的不同，将DEGs分为10个聚类。我们注意到簇2和簇3，其中DEGs在病例组中表达上调，但在达格列净治疗后表达下调（图3）。结合RNA测序和ATAC分析的结果，我们发现了三个炎症相关基因在三组中表现出相反的调控趋势，即Isg15、Btla和Csf2rb（图4）。Isg15（图4A-C）和Csf2rb（图4A，F-G）显示糖尿病小鼠染色质可及性和mRNA水平上调，达格列净治疗后减弱。在本研究中，包括三组所有小鼠的单变量分析显示，Isg15的表达水平与高血糖和UACR呈正相关（图5A，B），提示其在DKD中起有害作用。我们还发现另一个促炎基因，肾脏中的Csf2rb mRNA水平与糖尿病小鼠的血糖浓度、血清尿素氮水平和UACR呈正相关（图5C-E），这意味着Csf2rb在DKD中应该是有害的。相反，抗炎基因Btla与血清肌酐浓度和UACR呈负相关（图5F-H）。

图2

图3

图4

图5

3. 达格列净在体内调节2型糖尿病小鼠的候选基因的表达并减轻肾脏炎症

在小鼠肾脏的蛋白质水平上测试了这些与炎症相关的分子，糖尿病小鼠的ISG15水平明显高于正常对照组，而达格列净治疗后则缓解了这一症状（图6A，B）。相反，在达格列净给药后恢复的病例组中，检测到免疫抑制因子BTLA的表达减少（图6A，B）。来自不同群体的肾脏与Ctrl组相比，糖尿病小鼠的蛋白表达有上调和下调（图6C）。基因本体论分析显示，Case组表现出明显的炎症细胞增殖和激活，以及JAK-STAT通路激活（图6D）。相比之下，用达格列净治疗的小鼠显示肾脏裂解液中的炎症蛋白整体下调（图6E）。达格列净导致两种特征明确的炎症标志物肿瘤坏死因子（TNF-a）和白细胞介素1（IL-1b）的显著下调（图6F)。

图6

4. 达格列净在体外对人肾小管细胞具有抗炎和抗纤维化作用，而不依赖于葡萄糖浓度

在高糖培养基中培养的肾小管细胞与在正常葡萄糖培养基中培养的细胞相比，ISG15上调，在相同的高糖浓度条件下，达格列净处理可缓解这种情况（图7A）。然而，在近端肾小管细胞中没有CSF2RB的表达，无论葡萄糖或达格列净治疗，BTLA水平几乎保持不变，这表明达格列净并没有直接影响肾小管细胞中BTLA的表达（图7A）。相应地，免疫印迹显示病例组的ISG15表达升高，而Dapa组的表达减弱（图7B，C）。随后，我们对细胞培养基进行了炎症相关抗体阵列分析，以进一步探索达格列净对高血糖状态下的肾小管细胞的影响。肾小管细胞在高糖培养基中倾向于产生更多的炎症分子（图7D），激活STAT通路，促进炎症反应（图7E）。达格列净添加可减弱炎症蛋白中HK-2的分泌（图7F），特别是众所周知的炎症标记物TNF-a和纤维化标志物将生长因子TGF-b（图7G），这意味着达格列净在糖尿病肾脏中具有抗炎、抗纤维化作用。此外，我们还检测到达格列净治疗对其他两种特征良好的炎症相关分子的改善，即TNF-b和IFN-g（图7G）。

图7

5. 达格列净在体外巨噬细胞中的一种新的抗炎作用

将永生化小鼠巨噬细胞细胞系（RAW 264.7）在体外培养，检测到高糖培养基中ISG15、BTLA和CSF2RB在mRNA和蛋白水平上的上调（图8A，C）。令人惊讶的是，达格列净治疗显著减轻了这些炎症分子的上调（图8A-C）。由于巨噬细胞可能隐藏各种细胞因子与多种细胞类型相互作用，我们还利用炎症相关抗体阵列分析在细胞培养基上清液中检测到了一系列分子。DEGs的结果在内皮细胞凋亡过程和白细胞趋化过程中富集，提示高血糖时的巨噬细胞可能诱导内皮细胞损伤，并招募其他白细胞来加剧炎症反应（图8D，E）。然而，根据抗体阵列检测，达格列净治疗似乎对巨噬细胞培养基上清液中的细胞因子影响不大。为了加深我们的研究，我们测试了葡萄糖水平和达格列净在巨噬细胞极化中的作用。高糖孵育激活巨噬细胞表达更高水平的Tnf-a、Il-1b、iNos、Il-10和Tgf-b，这意味着复杂的巨噬细胞激活和极化过程与不同表型的结合（图8F）。

图8

6. 达格列净在缺血/再灌注诱导的小鼠CKD模型中减轻肾脏损伤，减轻肾脏炎症

缺血/再灌注（I/R）手术后7天，CKD小鼠血清肌酐和尿素氮水平升高，而血糖保持不变。相比之下，达格列净治疗可显著恢复肾功能，降低血糖水平（图9A-C）。检测了小鼠肾脏中BTLA和ISG15的蛋白水平。与Ctrl组相比，达格列净治疗的健康小鼠BTLA表达增强，其ISG15表达似乎下降，但没有达到显著的阈值，可能是由于基线时ISG15蛋白水平较低（图9D，E）。此外，I/ R手术下调肾脏BTLA，上调肾脏ISG15，达格列净可改善这种促炎状态（图9D，E）。

图9

参考文献:

Cai A, Shen J, Yang X, Shao X, Gu L, Mou S and Che X (2023) Dapagliflozin alleviates renal inflammation and protects against diabetic kidney diseases, both dependent

and independent of blood glucose levels. Front. Immunol. 14:1205834. doi: 10.3389/fimmu.2023.1205834

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