2020 年 11 月 26 日，Kiel University 在 Immunity（IF：21.5）上在线发表了一项研究，利用 14 名患者的多个外周血样本分析了 bulk 转录组、bulk DNA 甲基化组和单细胞转录组。结果显示重度 COVID-19 患者的特点是增殖、代谢增强的浆母细胞增加，同时研究人员还发现 IFN 激活的循环巨核细胞扩张，红系生成增加，且具有缺氧信号的特征。巨核细胞和红细胞衍生的共表达模式可能对疾病结果具有一定的预示功能。该研究表明 SARS-CoV- 2 感染影响了多种细胞的广谱免疫功能。
1、实验设计
14 个住院的 COVID-19 患者的 5 个外周血样本，作者采用了 scRNA-seq（10x Genomics），单细胞 B 细胞受体（BCR），RNA-seq、DNA 甲基化分析和多重细胞因子 ELISA 分析（图 1A）。作者使用了经过修改的 WHO 序数量表，该量表还考虑了几种炎症标志物（血清 C 反应蛋白 [CRP]，血清 IL- 6 和铁蛋白），该分数用于对患者的病程进行分类（图 1B 和 1C）。
图 1 用于疾病轨迹分析的疾病阶段的临床定义
2、scRNA-seq 分析确定细胞分化轨迹
scRNA-seq 共得到 358,930 个细胞的数据，每个样品平均有 10,900 个细胞；注释得到 37 个不同的细胞亚群；聚类结果显示单核细胞亚群中个体间的异质性较高；跨时间点的计数揭示了几种细胞类型的变化，包括单核细胞，增生性淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞，经典 CD14 + 单核细胞的增加，尤其是在恢复期，而非经典 CD16 + 单核细胞的数量在拟时序 2 和 3 都增加了，研究发现 COVID-19 患者外周血中几种源自骨髓的前体细胞类型的存在增加，并且在整个疾病过程中，巨核细胞（MK）比例明显升高。
图 2 沿拟时序结果 UMAP 展示
3、 全血转录组特征沿 COVID-19 疾病轨迹动态变化
接下来分析了 13 个住院患者的全血转录组学数据，从较多 5 个时间点开始与恢复对照进行比较，并将特征与 14 个健康对照进行比较。在健康对照和 COVID-19 患者之间，在对照与每种疾病轨迹假时的成对比较中，共有 5,915 个基因差异表达。与健康对照组相比，COVID-19 患者中大多数差异表达基因（DEG）的表达水平更高。早期变化包括免疫球蛋白转录本（IGHA1 和 IGHG1）和乳铁蛋白（LTF）的增加，而编码 Th17 特异性转录因子（TF）和 II 类 HLA 转录本的 RORC mRNA 水平在整个病程中均下降。IL-1β 和血管舒张信号转导相关的基因在增量轨迹中（拟时序 1）高表达。从逐渐恢复到晚期恢复期（拟时序 1、3 和 4），编码核糖体结构蛋白的转录物大量减少，这可能反映了 I 型干扰素对蛋白合成装置的普遍抑制。相反，在疾病活动高峰期，与 IFN 相关的转录产物显著增加，但是在关键疾病类别中却受到抑制。通过构建代谢模型，发现与康复和健康个体相比，炎性疾病状态与更高数量的预测代谢活性途径相关。
图 3 COVID-19 中全血基因表达的动力学
4、纵向共表达模块可确定关键疾病中干扰素应答的受损 以及血栓和红细胞生成增加的特征
作者使用从成对和纵向分析（6,317 个基因）的组合中识别出的所有 DEG 进行加权基因共表达网络分析。分析确定了共 10 个共表达基因的模块，M1-M10，它们在整个 COVID-19 疾病阶段遵循不同的表达方式。评估模块与 scRNA-seq 结果的细胞类型和临床参数之间的个体相关性 C。在 scRNA-seq 数据上预测每个模块的 hub 基因的表达，揭示了细胞类型和拟时序特异性表达模式。基因集富集分析揭示了每个模块中富集的生物学过程和途径。
图 4 差异表达基因的共表达分析和甲基化变化的整合
5、全血 DNA 甲基化分析揭示了与基因表达相关的 COVID-19 中的全基因组低甲基化
与健康对照进行成对比较，在拟时序之间鉴定出 46,071 和 69,733 个差异甲基化的 CpG 位点，与健康对照相比，每个时间点都存在大量的低甲基化位点。细胞反卷积分析鉴定出与 COVID-19 相关的 DNAm 基因的主要部分来自粒细胞，B 细胞，NK 细胞和单核细胞。
图 5 COVID-19 的全基因组 DNA 甲基化
6、 整个 COVID-19 疾病轨迹的成浆细胞和 B 细胞变化
将 scRNA-seq 数据中 22190 个 B 细胞提取出来，将 B 细胞细分，其中包括 11509 个记忆 B 细胞，3993 个 naïve B 细胞，383 个过渡性 B 细胞和 6,295 PB 细胞。在 COVID-19 期间，PB 在很大程度上处于扩张状态，在高炎症期处于高水平；富集分析发现 PB 中代谢通路显著富集。来自炎症状态的 PB 表现出较高的代谢活性，仅在恢复时才降低，而记忆和 naïve B 细胞在疾病状态之间的总体代谢活性上没有显示出显著差异。PB 中增加的代谢过程是氧化磷酸化，乙醛酸和二羧酸酯代谢，NAD 合成以及各种氨基酸代谢途径（包括甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸，苏氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸）的增加。预计糖酵解在炎症疾病阶段具有低活性状态，而在临床恢复中则具有很高的活性（拟时序 6）。该分析确定了 PBs 的广泛活化，并暗示了细胞向氨基酸代谢的强烈的免疫代谢转变，这可能有助于重症 COVID-19 中所见的免疫病理学。
图 6 B 细胞亚群细分
7、 巨核细胞数量升高是 COVID-19 的全身炎症反应的特征
将 5,870 个巨核细胞分成两个亚群，HSC 和 MEP，与健康对照组相比，恢复期的 HSC 和 MEP 显著增加，在危重患者中观察到伪编码丙酮酸激酶的 PKM 转录量（PKM2）大量增加，并与 HIF1A 相互作用并促进其活性（拟时序 2）。在这一组中，还存在高表达的 FCER1G，它编码负责整合素（ITGA2-GP6）介导的血小板粘附的常见 FcRγ 链衔接子。尽管与健康对照组比较其水平低于 PBs，但是代谢建模确定了 MKs 沿疾病轨迹增加的代谢活性。预测过程与能量代谢（丙酮酸代谢，糖酵解和活性氧 [ROS] 解毒）显著相关。
图 7 巨核细胞水平升高是 COVID-19 的特征
文章提到细胞类型的 marker
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