伯豪学院

文章展示

实验技术：WES+16S rDNA 测序 + 甲基化芯片

期刊：PNAS        

时间：2019.12.26

研究路线

主要结果

FMT 移植小鼠：结肠组织中与生物异常相关的组织学改变

FMT 后，N- μ 组表现正常。而 CRC- μ 或 AOM 单独处理，以及 CRC-μ+AOM 处理组都表现出了轻微的炎症反应，以及异常隐窝病灶。通过 mRNA 细胞因子定量评估，AOM 治疗倾向于放大这种刺激作用。此外，对整个组织学检查肠粘膜髓细胞的半定量评估显示，与 N - μ 相比，CRC- μ 的粘膜髓细胞数量有增加的趋势，但在任何时间点都没有达到统计学意义。

图 A -G: 组织病理学变化；图 H: 对细胞增殖，病理癌变的的影响；图 I:ACF 的数量；图 J：粘膜炎症变化；图 K: 肠粘膜髓细胞的变化。

小鼠体内 FMT 后的微生物区系特征变化

为了评估微生物群落对观察到的粘膜表型差异的影响，对小鼠粪便样本进行 16S rDNA 测序分析，结果显示，在基线水平下，与 N - μ 组相比，CRC-μ(n = 9 个供体）组的粪便微生物群中梭杆菌、帕维单胞菌、丁酸弧菌、和低比例的 Ruminococcus，双歧杆菌、真细菌和 Lachnospira。随访期间，各组的 Coccoides, Clostridium leptum,  和  Bifidobacterium 均出现中度下降。此外还发现，组织学改变与起到抗炎作用的细菌含量减少相关（Faecalibaterium，Eubacterium  以及厚壁菌门的种属）。

FMT 对小鼠 DNA 突变的影响

为了分析 FMT 对宿主进行 DNA 修饰的影响，研究人员对小鼠结肠黏膜组织进行全基因组测序，覆盖 24000 个基因中的 220,000 个外显子。小肠组织中整体外显子 / 内含子水平的突变发生率明显高于脾脏组织。在结肠黏膜中，N- μ 组在外显子或内含子的 DNA 发生改变要比 CRC- μ 组低，但并没有达到显著性。此外，给予 CRC-μ+AOM 组的小鼠显示出高水平的外显子或内含子的 DNA 改变。为了分析 CRC- μ 诱发的局部致癌潜力，作者继续对以下选择的基因通路进行了深入分析：Wnt 和 catenin(19 个）、Notch(4 个）、PPAR(3 个）、SMAD(2 个）、TGF- inhibitor 2 个基因，ACRV 2 个基因，DKK 4 个基因，TCF 2 个基因，MYC 1 个基因，SOCS 1 个基因。显著的变化发生在关键的 Wnt 通路基因中（11 个 Wnt 基因中存在 indel 和单核苷酸多态性），CRC- μ 组和 N - μ 组之间没有显著差异。根据结肠粘膜或脾脏样本中单核苷酸的总 DNA 变化，对动物进行亚群分析，表明基因突变与微生物类型（N 或 CRC) 或给小鼠的治疗（生理盐水或 AOM) 有关。

图 A：CRC 粪便处理组比对照组，在 exon 和 intron 上的 SNP 位点要多，但是不显著；图 B：基于 SNP 的 PCA；图 D：不同组间 Wnt 基因突变率比较，AOM +CRC- μ 组高

FMT 对小鼠 DNA 甲基化的影响

在小鼠结肠粘膜组织，CRC- μ 相对于 N - μ 可以诱发更大的表观遗传改变。N-μ + NaCl  甲基化高于 CRC-μ + NaCl  高于 CRC-μ + AOM  组；CRC-μ + AOM  组的为甲基化探针数比 N -μ + NaCl   组高 11%，CRC-μ  和 AOM  处理后，完全甲基化的探针较高。

结肠癌病人样本中的基因甲基化

通过检测血液，粪便，CRC 组织和排泄物（n = 9) 和正常组排泄物（n = 9) 的甲基化，从高甲基化的基因上，选出 8 个在所有样本中都一致的基因（Wif1-regulating gene and SEPT9, SFRP1,2,3,PENK, NPY, and ALX4 genes），确定了 3 个基因进行验证。三个基因和一个看家基因的 CMI 值可以区分 CRC 和正常人，specificity and the sensitivity of CMI > 2 in blood was 95 and 59%。多因素分析显示 CMI 是 CRC 诊断的独立危险因素，包括粪便免疫化学血液检测。

微生物组成与 CMI 的关系

根据基因的 CMI 值可以把群体分成两类，CMI 大于 2 和 CMI≤2。宏基因组分析显示，在 CMI > 2 患者（n = 53) 和 CMI≤2（n = 90) 患者中，包括几种 Parvimonas(单胞菌）在内的 20 种细菌在丰度上存在差异。

结论

CRC 相关的微生态失调导致宿主基因甲基化，相应的 CMIs 和相关细菌可能是 CRC 的 biomarkers。

参考文献：Colorectal cancer-associated microbiota contributes to oncogenic epigenetic signatures. Sobhani et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2019)