导读

近日，Microbiol Spectr 杂志发表了一项初步研究，旨在探索 DNA 甲基化与结核潜伏感染（LTBI）人群活动性肺结核发生的关联研究。该研究主要由中国医学科学院病原生物学研究所完成，研究采用巢式病例对照设计，回顾性检测 LTBI 人群中发展为活动性肺结核者与未发病者 DNA 甲基化程度，探索 DNA 甲基化与 LTBI 人群发生活动性肺结核的关系，为寻找 LTBI 与活动性肺结核的鉴别诊断生物标志物提供新的思路。中国医学科学院病原生物学研究所的博士生杜莹为文章的第一作者，高磊研究员与辛赫男副研究员为文章的通讯作者。

科学问题

针对 LTBI 高危人群开展预防性治疗是直接降低发病率，实现 2035 年“END TB”全球战略目标的重要手段。目前，肺结核的诊断仍然是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检测为主，存在敏感性低、周期长、易受痰标本质量影响等问题。探索基于宿主血液的生物标志物用于诊断活动性肺结核一直是领域内的研究热点。DNA 甲基化是目前研究比较广泛的表观遗传方式，本研究以此为切入点，探索 DNA 甲基化与活动性肺结核发生的关系。

实验设计

样本： 外周血 PBMC

分组： 分别收集基线及随访时的自身前后两份外周血样本进行分子标识研究。基线时共 1155 例未进行预防性治疗的结核潜伏感染者参与了该研究，通过 5 年随访，共有 26 例研究对象发展为活动性肺结核，从中选择有足够外周血单核细胞的 15 例调查对象作为病例组，并根据年龄、性别匹配了 15 例未发生活动性肺结核的调查对象作为对照组。

技术：850K 甲基化芯片（伯豪提供）

实验思路

实验结论

1. 调查对象基本信息

对 30 例研究对象的自身前后两份样本共 60 份样本进行了 850K 芯片筛选，其中包括 15 例结核病患者（11 例病原学确诊病例及 4 例临床确诊病例）和 15 例年龄、性别匹配的结核潜伏感染对照组。30 例调查对象的年龄中位数为 65（62，68）岁，以男性居多（73.33%，22/30）。两组的 IFN- γ 释放水平、吸烟和饮酒间差异无统计学意义，其中，病例组的 BMI 低于对照组（P=0.025），但均在正常范围内。

▲表 1   LTBI 人群队列信息特征

2. 甲基化芯片筛选结果

850K 芯片对每例参与者的自身前后两份样本进行检测并评估全基因组 DNA 甲基化程度。共分析了 60 份血液样本中 86 万多个 CpG 位点的甲基化状态。在研究终点，病例组和对照组之间有 2826 个显著差异甲基化位点，在病例组自身前后，共有 78110 个显著差异甲基化位点。为了达到在结核潜伏感染人群中鉴别诊断活动性肺结核的目的，作者选择研究终点时病例组和对照组之间的差异甲基化位点，并且同时满足病例组自身前后甲基化程度发生改变，对照组自身前后甲基化差异没有统计学意义，共得到 134 个甲基化位点作为候选分子标识。

为了进一步分析随访期间病例组和对照组之间的 2826 个 dmCpGs 所在基因的生物学功能，进行 GO 和 KEGG 富集分析。通过 GO 功能分析，结果表明，dmCpGs 主要富集于胰岛素分泌的生物过程中，涉及对葡萄糖刺激的细胞反应、涉及吞噬作用的 Fc- γ 受体信号传导途径和钙离子螯合的调节。KEGG 分类结果表明，这些 dmCpGs 主要富集在细菌感染性疾病和癌症中。

图 2   富集分析结果

在 134 个差异甲基化位点中，选择位于 TSS 置 200bp 或者 TSS1500bp 的位点，共得到 8 个候选甲基化位点做进一步分析，其中 6 个位点为高甲基化状态，2 个位点为低甲基化状态。

3. 差异甲基化的诊断效能

8 个 dmCpGs 的 AUC 在 0.72 ~ 0.84 之间。其中，位于 SIRT1 基因 CPG 岛启动子区的 cg12159502 位点呈现佳 AUC，为 0.84)，敏感度为 73.33%，特异度为 86.67%。按照 WHO 的 TPP 准则，对于给定的 93.33% 的敏感度，cg14593639 的特异度高，为 66.67%。

表 2 8 个位点的区分能力评价

随后，作者计算了 8 个 dmCPGs 不同组合形式的诊断效能。共有 247 个不同的组合），有 52 个组合的诊断效能符合世界卫生组织 TPP 基准。其中，“SIRT1+SIRT5+GNB2L1+FLJ44635”组合表现佳，敏感度为 93.33%，特异度为 86.67%。

表 3 8 个位点的区分能力评价

初步结果提示，SIRT1 等基因 CPG 岛启动子区 DNA 高甲基化可能作为在 LTBI 人群中鉴别活动性肺结核的生物标志物，在 LTBI 高危人群中进行系统筛查不仅可以实现早期发现病人，还可以快速的鉴别出活动性肺结核患者并尽早对其开展预防性治疗。考虑到亚临床结核和病原学阴性的肺结核患者，与基于痰液样本的检测方法相比，基于血液的生物标志物可大大提高诊断敏感性及时效性。鉴于纳入研究样本量有限，本研究结果尚需在大样本的独立人群中进一步验证。

参考文献

Du Y, Gao X, Yan J, et al. Relationship between DNA Methylation Profiles and Active Tuberculosis Development from Latent Infection: a Pilot Study in Nested Case-Control Design. Microbiol Spectr, 2022 Apr 21:e0058622. doi: 10.1128/spectrum.00586-22

来源：中国防痨杂志期刊社