标题：Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing
期刊：Cell（IF=41.582）
导读
过去的几十年里，癌症免疫疗法极大地改变了肿瘤治疗的局面，诸如检查点阻断之类的疗法可以显著改善患者的临床反应，但这些疗法的效果在癌症患者或癌症类型之间存在极大差别。因此，确定可预测治疗反应的生物标志物至关重要。
2017 年 6 月，张泽民教授及其团队在《Cell》期刊上发表了题目为“Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing”的研究论文，该研究通过大规模单细胞测序技术对肝癌相关 T 淋巴细胞进行分析，初次在单细胞水平上描绘肝癌微环境中免疫细胞图谱，发现了肝癌免疫疗法的潜在靶点，也为我们从多角度系统性理解肝癌 T 淋巴细胞特征奠定了基础。
科学问题
淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中起主要作用。因肿瘤浸润淋巴细胞在不同患者及不同癌种间具有高度异质性，这些异质性导致肿瘤免疫治疗效果差异显著。突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 水平和药物靶点表达等几个因素与患者对抗 CTLA4 或抗 PD1 疗法的反应有一定的相关性，但这些通常不够稳健，无法统一用作临床生物标志物。因此，确定可预测治疗反应的生物标志物至关重要，而新型癌症免疫疗法的开发和有效生物标志物的鉴定需要对肿瘤驻留 T 细胞的深入了解。
实验设计
实验分组
对照组：来自 6 例肝癌患者的外周血，肝癌组织的 T 细胞
实验组：来自相同 6 位肝癌患者的癌旁正常组织的 T 细胞
实验关键技术
单细胞 RNAseq，流式细胞术
实验结果
1、肝癌相关 T 淋巴细胞亚型分析
为揭示肝癌相关 T 淋巴细胞内在特性及其潜在的功能亚型，作者对来自 6 位肝癌患者外周血、邻近正常组织和肿瘤组织的 CD8+ 细胞毒性 T 细胞（PTC、NTC 和 TTC）和对应位置的 CD4+ CD25- T 细胞（PTH、NTH 和 TTH）及 CD4+ CD25high T 细胞（PTR、NTR 和 TTR）进行单细胞转录组测序。对测序结果降维聚类，共聚类为 11 个 T 细胞亚群：5 个 CD8+ T 细胞亚群和 6 个 CD4+ T 细胞亚群，每个亚群都有其独特表达的特征基因。其中 C1_CD8-LEF1，主要是来源于外周血，特异性表达 naïve T 细胞标记基因；C2_CD8-CX3CR1，高表达 T 细胞效应功能相关基因；C3_CD8-SLC4A10, MAIT（Mucosal-Associated Invariant T cells）细胞；C4_CD8-LAYN，主要来源于肿瘤组织，高表达耗竭性标记基因；C5_CD8-GZMK，与 C4 存在一些共同表达的基因，但特异表达 GZMK 基因。其中 C1_CD8-LEF1 T 细胞亚群和 C2_CD8-CX3CR1 细胞亚群主要存在于外周血中，MAIT 细胞主要分布在肿瘤相邻的正常肝组织中，而在肿瘤组织中主要为耗竭性 CD8+ T 细胞。
CD4+ T 细胞分为 6 个亚群：C6_CD4-CCR7 亚群主要来源于外周血，特异表达初始 T 细胞标记基因，C7_CD4-FOXP3 主要是外周血分离的 Tregs 细胞，C8_CD4-CTLA4 是一群在肿瘤组织中高度富集的 Tregs 细胞，C9_CD8-GZMK，主要是来源正常组织和肿瘤组织中的 Th 细胞，C10_CD4-CXCL13 是一群耗竭性 CD4 T 细胞。C11_CD4-GNLY 是一群具有细胞毒性的 CD4 T 细胞。
图 1. T 细胞亚型分析
2、HCC 浸润性 Tregs 和耗竭性 CD8+ T 细胞特有相关基因的确定
由于 HCC 浸润性 Tregs 细胞亚群（C8_CD4-CTLA4）和耗竭性 CD8 T 细胞亚群表达的共抑制受体（如 PDCD1 和 TIGIT）是癌症免疫疗法的重要靶标，因此作者选择这两个 T 细胞亚群做进一步的分析。在肿瘤侵润性 Tregs 中共鉴定出 401 个特异表达基因，如 FOXP3、CTLA4、TNFRSF18、TNFRSF4 和 CCR8 等；在肿瘤耗竭性 CD8 T 细胞中，获得了 82 个特异性耗竭标记基因，其中除了已报道过的耗竭标记基因，还发现了新的耗竭相关基因，如 LAYN，PHLDA1 和 SNAP47 等。其中 22 个耗竭标记基因（如 CTLA4 和 LAYN）也在肿瘤侵润性 Tregs 细胞中高表达。
上述结果中，作者发现 LAYN 基因在肿瘤侵润 Tregs 和耗竭性 CD8+ T 细胞中特异性表达，且 LAYN 的高表达与低生存率有关。因 LAYN 是一种细胞表面蛋白，作者通过流式细胞术发现，静息期的 CD14+ 髓细胞、B 细胞、CD4+ T 细胞、Tregs 或 CD8+ T 细胞中并不表达 LAYN，但用抗 CD3 和抗 CD28 抗体激活 T 细胞 2 天后，超 30% 的 Tregs 细胞和 CD8+ T 细胞中检测到了 LAYN 的表达。已知 FOXP3 是 Treg 细胞分化和功能相关的关键转录因子，而转录因子 Helios 能够稳定 FOXP3 的表达，抑制 Tregs 细胞功能。因此，作者进一步分析了 FOXP3+ Helios+ Tregs 细胞中 LAYN 的表达。结果显示，在 FOXP3+ Helios+ Tregs 细胞中，LAYN 被优先上调，表明 LAYN 可能与 Tregs 细胞抑制性和稳定性有关。而在 CD8 T 细胞中过表达 LAYN 后，IFN- γ 明显减少，说明 LAYN 的表达与 T 细胞抑制性有关，也进一步证实了肿瘤微环境中的 T 细胞更易于向耗竭态转变或存在 Treg 抑制，从而阻止 CD8 T 细胞对肿瘤细胞杀伤作用。
图 2. HCC 浸润 Treg 细胞和耗竭 CD8+ T 细胞基因表达特性
3、TCR 分析及拟时序分析子集映射
已知由同一细胞分化而来的 T 细胞具有相同的 TCRs, 作者分析每个样本的 TCR 数据发现，虽然大多数细胞含有独特的 TCR，但在不同细胞类型中观察到不同程度的重复使用模式，尤其在肿瘤浸润 CD8+ T 细胞和 Treg 中，表明两种细胞存在共同的祖先细胞起源。且肿瘤组织 CD8+ T 细胞和 Treg 细胞中 TCR 克隆的数量显著高于血液和邻近正常组织中的数量，这很可能是肿瘤环境中局部 T 细胞增殖和激活的结果。
拟时序分析构建 CD8+ T 细胞和 CD4+ T 的发育轨迹。CD8+ T 细胞拟时序结果显示，每个簇中的大多数细胞基于表达相似性聚集，不同的簇在伪时间中形成连续分化过程，从 C1_CD8-LEF1 细胞（幼稚 CD8+ T 细胞）开始，然后是 C2_CD8-CX3CR1（效应记忆 CD8+ T 细胞）、C5_CD8-GZMK，并以 C4_CD8-LAYN 细胞（耗竭 CD8+ T 细胞）结束。耗竭 T 细胞在伪时间后期高度富集，表明 T 细胞状态从激活过渡到耗竭。CD4+ T 细胞拟时序分析结果显示，C6_CD4-CCR7 幼稚 T 细胞和 C9_CD4-GZMA T 辅助细胞主要聚集在伪时间主干上，C10_CD4-CXCL13（耗竭 CD4+ T 细胞）和 C11_CD4-GNLY（细胞毒性 CD4+ T 细胞）细胞位于伪时间轨迹图中的不同方向，表明这些细胞在功能上存在差异。
图 3. 肝癌 T 细胞克隆分析及拟时序分析
4、HCC 微环境中耗竭性 CD8+ T 细胞和 Treg 细胞克隆富集
随后作者重点分析了 HCC 肿瘤浸润 T 细胞，发现肿瘤微环境中的效应 CD8+ T 细胞显著减少，而耗竭表型显著上升。此外，有少量耗竭 CD8+ T 细胞表达 Treg 标记物 FOXP3，这些细胞还表达细胞溶解相关基因，表明这群细胞存在抑制性和细胞杀伤特性。HCC 微环境促进浸润的 CD8+ T 细胞转变为衰竭状态，从而抑制 CD8+ T 细胞对肿瘤细胞杀伤作用。
参考文献：
1. Zheng C, Zheng L, Yoo J-K, et al (2017) Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169:1342-1356.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.035.
