Visium 空间转录组是在组织原位检测全转录组基因表达的一种技术，使得我们在检测基因表达水平的同时，获得基因在组织内部空间表达的位置信息。与空间转录组相比，传统的全基因转录组或单细胞转录组测序，丢掉了基因或细胞在组织内的空间分布信息，而广泛应用的 RNA 探针杂交，这只能同时检测有限的几个基因在组织内的空间表达分布。而空间转录组可以将基因表达与 H &E 染色的结果叠加在一起，不需要对组织进行消化，从而保留了组织内部的空间结构，这样使得我们可以研究组织内部不同区域的细胞异质性。
Visium 空间转录组的工作原理？
Visium 基因表达玻片上有 4 个捕获区域，也就是图片上展示的 4 个小方框，每个捕获区域的大小是 6.5mm 乘 6.5mm，每个捕获区域大约有 5000 个 spot，也就是图上所示的小圆点，每个 spot 的直径是 55µm，两个 spot 的中心点的距离是 100µm，每个 spot 上面有数百万条 oligo。每个 spot 上所有 oligo 的 Spatial Barcode 的序列都是相同的，而不同的 spot 之间 Spatial Barcode 是不同的，这样通过 Spatial Barcode，就能够知道每条 mRNA 到底位于哪个 spot，也就获得了 mRNA 的空间位置信息。UMI 用于基因表达定量，可以知道每个 spot 上有哪些基因表达以及他们的表达量。poly- A 用于捕获 mRNA。4 个捕获区域内的 Spatial Barcode 是相同的，但每个捕获区域内不同的 spot 之间 Spatial Barcode 是不同的。
公司内部空间转录组实验流程？
总实验流程分为三个部分：
一是样本制备及预实验，二是组织优化，三是基因表达。
样本制备及预实验实验流程：
首先获取组织样本，进行冷冻，OCT 包埋，将包埋好的组织进行冰冻切片，将切好的组织放置于常规玻片上。接下来对组织切片进行固定，H&E 染色，用带扫描功能的显微镜对组织切片进行明场拍照。同时切 10 片厚度为 10 µm 的冰冻切片，提取 RNA，通过计算 RIN 值来评估其质量。为了获得先进的实验结果，建议用 RIN 值大于 7 的组织块做 Visium 的实验。
组织优化的实验流程：
首先对 OCT 包埋的组织进行冰冻切片，将切好的组织放置于组织优化玻片上的捕获区域。接下来对组织切片进行固定，H&E 染色，用带扫描功能的显微镜对组织切片拍照，拍照完成后会继续对组织切片进行通透处理，使细胞内的 mRNA 释放出来，被玻片上的 oligo 所捕获，在合成一链 cDNA 的时候，掺入带有荧光基团的碱基，这样合成好的 cDNA 就带有荧光，接下来会通过酶消化去除玻片上残留的组织，暴露带有荧光的 cDNA，用 Cy3 通道的荧光显微镜，扫描整张片子，获得荧光染色的图片，组织优化的所有实验都在玻片上完成。
基因表达实验流程：
先对 OCT 包埋的组织进行冷冻切片，将切好的组织切片放置于基因表达玻片上的捕获区域。接下来对组织切片进行固定，H&E 染色，用带扫描功能的显微镜对组织切片进行拍照，获得组织形态信息。拍照完成后会继续对组织切片进行通透处理，使细胞内的 mRNA 释放出来，被玻片上的 oligo 所捕获，在玻片上进行一链和二链 cDNA 的合成，合成二链 cDNA 后会做变性处理，将合成好的二链 cDNA 回收到 ep 管中，后面的所有实验都在 ep 管中完成，包括 cDNA 的扩增和文库的构建。空间基因表达实验可以分为两个部分，首部分从组织固定到二链 cDNA 的合成，都是在基因表达玻片上完成。次部分从 cDNA 的扩增到文库的构建，都是在 ep 管中完成。
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是否与 Visium 兼容？
目前只有包埋在 OCT 中的新鲜冷冻组织经过了 Visium 空间基因表达解决方案的验证。10X Genomics 的研发团队成员正在积极研究 FFPE 组织相关的应用，并且已经获得一些初步结果，推出适用于 FFPE 组织的实验方案。
组织是否可经过 IHC 染色？
目前，Visium 空间基因表达流程是针对 H &E 染色而优化的。将 IHC 染色整合到此流程中是 10X Genomics 研发团队积极研究的另一个领域，预计在 2020 年上半年推出。
H&E 染色是否会对样本 RNA 质量产生影响？
不会，10X Genomics 官方实验结果表明，H&E 染色不仅不会对样本 RNA 质量产生影响，染色后还会提高基因检测数。
组织或切片样本的转运？
运输组织样本：将冻存好的组织放在密封的容器中，再将装有冷冻组织的容器用密封袋封好，放置于干冰中运输，样本到达目的地后迅速转移到 -80℃冰箱保存。
运输已经贴了组织切片的玻片：可以将玻片放置于密封的容器中，并将玻片固定好，再将装有玻片的容器用密封的袋子封好，放置于干冰中运输。同样样本到达目的地后，迅速转移到 -80℃冰箱进行保存。这里还要注意，一旦玻片上贴好了组织切片，只能保存 7 天。
Visium 空间转录组目前不能够做什么组织样本？
在 10X 测试过的组织类型中，有三种组织还需要进一步的优化，包括样本制备的优化和组织通透性的优化，分别是皮肤，胰腺和骨组织。
Visium 空间转录组能够做何种组织类型以及推荐切片厚度是什么？
10X Genomics 测试过很多组织类型，大多数都可以用于空间转录组的分析。下图是他们官网上测试过的组织类型的列表，测试过的组织都可以运用在空间转录组的分析上面。但建议用户用基因表达玻片做正式实验前，务必用组织优化的玻片测试一下，看组织能否用于空间转录组的实验，同时也找到好的组织通透时间。
切片厚度基本上以 10µm 为主，但也有少量组织例外。
一张 Visium 空间基因表达玻片上可以运行不同类型的组织吗？
可以，Visium 空间基因表达玻片上可以检测不同类型的组织。每张玻片包含 4 个捕获区域，因此一张玻片上至多可检测四种不同类型组织的切片。每种组织的透化时间需要通过组织优化（TO）实验来预先确定，每种类型的组织使用一张 TO 玻片。
一个捕获点可以捕获不止一种类型的细胞吗？
是的，根据组织中待研究的具体区域，带条形码的捕获点可能覆盖不止一种类型的细胞。具体取决于组织类型、组织内的细胞大小以及这些细胞的密度。研究人员可看到每个点大约捕获 1 到 10 个细胞。您可以将每个捕获点想象为一种“微型批量”的实验，在这个实验中，研究人员收集一小批细胞的平均基因表达数据。这是 10x Genomics 的研究团队正在积极研究的另一领域，目的是尽量让捕获点变得更小。
如果有些捕获区域未使用，那么 Visium 空间组织优化或基因表达玻片是否可以重复使用？
无论您在处理过程中是否使用了所有捕获区域，玻片仅供一次性使用。这是因为流程中包含了多个步骤，包括对玻片进行染色、冲洗和重新干燥，这些步骤会破坏未使用的捕获区域上的寡核苷酸条形码，并降低其整体的灵敏度。
成像测试玻片的作用？
Visium 配件试剂盒中的成像测试玻片有两个用途。
一，确定客户的成像系统是否与 Visium 兼容。
二，用于成像程序的设置，以便在 Visium 组织优化和基因表达流程中获取图像。
如何确定组织切片的空间位置信息？
在捕获区域四周有一圈由灰色小点组成的基准边界，提供组织切片的空间定位信息。
Visium 空间转录组对测序读长的要求？
Visium 空间转录组的文库，可以在 Illumina 所有测序仪上测序，文库的结构如下图所示，需要双端 index 测序。
建议的测序方式是为 Read 1：28 个 bp，i7 index：10 个 bp，i5 index：10 个 bp，Read 2：120bp。Read 1 用于测试 Spatial Barcode 和 UMI，Read 2 用于测试插入片段。不建议将 visium 的文库与其他单 index 的 10x 文库混合测序。
Visium 空间转录组对测序深度的要求？
与单细胞实验不同，我们无法根据细胞数计算空间转录组文库的测序量，因为我们不知道组织切片当中有多少细胞，我们根据组织切片占捕获区域的比例计算测序量，计算测序量的时候，只考虑被组织切片覆盖的 spot，每个 spot 的推荐底限起始测序量是 5 万个 read pairs，根据 H &E 染色的结果可以估算捕获区域到底有多少百分比的 spot 被组织覆盖。
计算测序量很简单，比如我们假设一个组织覆盖了捕获区 50% 的面积，我们就用 0.5×5000×5 万个 read pairs per spot，得出测序量是 125 个 million read pairs。这里面 0.5 就代表着覆盖了捕获区域 50% 的面积，5000 就代表着每一个捕获区域总共有 5000 个 spot，再乘以 5 万，5 万就是每个 spot 我们推荐的底限测序的量，就是 5 万个 read pairs per spot。测序量与组织大小、组织类型和基因表达水平相关。
在分析数据时是否需要编程或生物信息学的经验？
通常，研究人员需要具备一点点生物信息学经验来使用 Space Range。Space Range 流程在 Linux 服务器上运行；这就需要研究人员了解基本的命令行操作，以及如何登录和退出 Linux 服务器。不过，在大多数情况下，Space Range 是高度自动化的。让软件正常运作的文件和算法都已经包含在内。因此，研究人员只需在测序后将两个输入文件提供给 Space Range，让软件生成空间基因表达数据。
Loupe Browser 有着完全图形化的界面，并且根本不需要编程。不过，您在研究过程中可能会碰到某个时刻，比如想了解空间基因表达数据的一个具体问题，或者创建一个自定义图形。那么，这就需要您学习 R 语言或其他脚本编程语言。
我已经对旧版本的空间转录组学（Spatial Transcriptomics）数据进行了测序，可以用 Space Range 和 Loupe Browser 来分析这些数据吗？
抱歉，不可以。因为数据类型不同，它们无法兼容。如果您有这种类型的数据，仍然建议您使用现有的处理空间转录组学数据的分析流程。
是否有类似于 Seurat 的第三方 R 语言工具来分析空间基因表达数据？
没错！事实上，分析空间基因表达数据的第三方工具的数量正在迅速增长。目前的一些选择包括 Spaniel 和 Giotto。Seurat 也是一种选择。Space Range 流程的输出矩阵与 Cell Ranger 的 Feature Barcode 输出矩阵的格式相同。研究人员可将此输出文件直接输入 Seurat 中进行进一步的分析。您可以通过 https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html 了解 Seurat 流程处理空间基因表达数据的更多信息。
此外，10x Genomics 的计算生物学家还创建了 R 资源，可以帮助客户对其样本开展深度分析。这些 R 资源让研究人员能够一次观察多个基因、样本或特征，如基因、UMI 和聚类。如果研究人员想分析不同特征的样本，或不同实验条件下的样本（如野生型、患病和治疗中的样本），这可能特别有用。您可以在我支持网站上访问这些 R 资源（https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit)。
伯豪生物 空间转录组测序服务优势
高质量切片：切片、贴片经验丰富，针对不同组织优化了解决方案。
流程化分析：完善的分析流程，准确快速解析空间转录组数据。
标准化内控：丰富的实操经验构建了标准化的内控体系。
专业化团队：资深的技术团队具有多年项目方案设计、实验操作、售后分析等经验。
全流程服务：提供组织冷冻包埋、贴片、切片、透化、建库测序及数据分析的全套服务。
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