伯豪生物
  1. 首页
  2. 伯豪学院
  3. 科研动态
  4. TCGA and GEO 转录组数据挖掘超级干货
伯豪学院
TCGA and GEO 转录组数据挖掘超级干货
发布时间：2020-09-29 浏览次数：8143
伯豪生物邓老师给大家介绍一下对转录组TCGA & GEO的数据进行分析，包括差异分析、富集分析、单基因展示以及其它个性化做图。

信息时代就是好，没有自己的数据咱可以从免费的数据库找数据呀！目前 TCGA 和 GEO 数据库简直就是专为科研人员准备的免费的宝库。前面一直讲的空间转录组，今天来穿插着讲一节 TCGA & GEO 数据分析换换口味吧。

今天主要给大家介绍一下对转录组 TCGA & GEO 的数据进行分析，包括差异分析、富集分析、单基因展示以及其它个性化做图。除了想利用公共数据库挖掘转录组数据的发文章的同学之外，这篇教程其实特别适合自己做了少量转录组样本又不想做后期验证，想直接用公共数据库的数据来验证自己数据结果的朋友。

目前各种 TCGA & GEO  数据下载的教程太多了，所以今天直接省略这部分部分，直接从后面的分析开始。废话不多说，直接上干货！

一、准备文件

基因表达矩阵文件，可以是 TCGA 下载的转录组数据，也可以是 GEO 下载的转录组数据，格式如下（行是基因，列是样本）：

1

样本分组文件，格式如下（type 是分组）：

2

二、差异分析

一般 TCGA 或 GEO 上大量样本数据的差异分析 limma 用的比较多，所以这里也使用 limma 包来分析差异基因，注意需要先安装 limma R 包。

安装 limma 包：

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))

    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("limma")

分析差异：

## 读取基因表达件，取 log2

geneexp = read.table("gene_exp_BRCA.txt",header=T,row.names=1,sep="\t")

geneexp = log2(geneexp+1)

## 读取分组文件

group_file = read.table("sample_group_BRCA.txt",header=T,row.names=1,sep="\t",as.is =TRUE)

rownames(group_file) = gsub('-','.',rownames(group_file))

geneexp = geneexp[,rownames(group_file)]

### 差异分组设置

samps<-factor(group_file$type)

design <- model.matrix(~0+samps) ;

colnames(design) <- levels(samps)

### 模型拟合

fit <- lmFit(geneexp, design)

cont.matrix<-makeContrasts(Basal-Normal,levels=design)

fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)

fit2 <- eBayes(fit2)

final<-topTable(fit2, coef=1, number=dim(geneexp)[1], adjust.method="BH")

> head(final)

           logFC  AveExpr         t       P.Value     adj.P.Val        B

SDPR   -4.358861 2.679133 -46.10828 8.888505e-122 4.738017e-117 267.4862

TPX2    4.030685 3.807811  45.39822 2.571983e-120 6.854979e-116 264.1584

UBE2C   4.089727 3.270516  43.72542 8.428935e-117 1.497681e-112 256.1483

CDC20   3.971916 3.450304  42.85468 6.270780e-115 8.356598e-111 251.8811

FIGF   -3.220704 1.583802 -40.93757 1.053838e-110 1.123497e-106 242.2399

FAXDC2 -2.179867 1.637909 -39.05494 2.084335e-106 1.851758e-102 232.4283

三、绘制差异基因散点图和火山图

这一步需要用到 ggplot2 绘图，没有安装的话需要先安装 ggplot2 包。

# 绘制差异基因散点图和火山图

library(ggplot2)

g1 = "Normal"

g2 = "Basal"

g1_exp = geneexp[rownames(final),rownames(group_file)[which(group_file$type==g1)]]

g2_exp = geneexp[rownames(final),rownames(group_file)[which(group_file$type==g2)]]

g1_mean = apply(g1_exp,1,mean)

g2_mean = apply(g2_exp,1,mean)

type=rep('No',length(g1_mean))

type[which(final$logFC> 1 & final$adj.P.Val <0.05)] = "Up"

type[which(final$logFC < -1 & final$adj.P.Val < 0.05)] = "Down"

datam = data.frame(g1_mean,g2_mean,logFC=final$logFC,FDR=final$adj.P.Val,type,stringsAsFactors=FALSE)

## 散点图

ggplot(datam,aes(g1_mean,g2_mean,colour=type))+

geom_point(stat="identity",size=1)+theme(legend.title=element_blank())+scale_color_manual(values =c("Down"='blue',"No"='grey',"Up"='orange'))+

    labs(x=paste(g1,'Log2(FPKM+1)'),y=paste(g2,'Log2(FPKM+1)'),title=paste(g2,'VS',g1,sep=""))+

    coord_cartesian(ylim=c(0,10),xlim=c(0,10))+geom_segment(aes(x = 0, y = 0, xend = 10, yend = 10),size=1,colour="#999999",linetype="dotted")+theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5),title=element_text(face="bold",size=15,colour="black"),axis.title=element_text(face="bold",size=13,colour="black"),axis.text.x=element_text(face="bold",size=12,colour="black"),axis.text.y=element_text(face="bold",size=12,colour="black"),legend.text=element_text(face="bold",size=13,colour="black"))

散点图结果如下：

3

## 绘制火山图

ggplot(datam,aes(logFC,-log10(FDR),colour=type))+

            geom_point(stat="identity",size=1.2)+theme(legend.title=element_blank())+scale_color_manual(values =c("Down"='blue',"No"='grey',"Up"='orange'))+

            labs(x="Log2 (FC)",y="-Lg10 (FDR)",title=paste(g2,'VS',g1,sep=""))+coord_cartesian(xlim=c(-5,5))+

            geom_hline(aes(yintercept=1.3),colour="white",size=1.1)+

            geom_vline(aes(xintercept =-1),colour="white",size=1.1)+geom_vline(aes(xintercept =1),colour="white",size=1.1)+

            theme(axis.title.y = element_text(vjust=-0.1),axis.title.x = element_text(vjust=-0.6),title = element_text(vjust=0.8))+theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5),title=element_text(face="bold",size=15,colour="black"),axis.title=element_text(face="bold",size=13,colour="black"),axis.text.x=element_text(face="bold",size=10,colour="black"),axis.text.y=element_text(face="bold",size=10,colour="black"),legend.text=element_text(face="bold",size=12,colour="black"))

火山图结果如下：  

4     

四、差异基因富集分析

这里我们介绍一下怎么用  clusterProfiler R 包来做差异基因富集分析。需要先安装好 clusterProfiler，org.Hs.eg.db 两个 R 包。

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))

    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("clusterProfiler")

BiocManager::install("org.Hs.eg.db")

GO 富集分析

library(clusterProfiler)

library(org.Hs.eg.db)

### 提取差异基因 list

diffgenes <- final[(final[,"adj.P.Val"]<0.05 & abs(final[,"logFC"])>=1),]

genelist <- diffgenes[,"logFC"]

names(genelist) = rownames(diffgenes)

##id 转换，将 SYMBOL 转换成 ENTREZID

gene = bitr(rownames(diffgenes), fromType = "SYMBOL", toType = "ENTREZID", OrgDb = "org.Hs.eg.db")

#####################GO 富集

ego <- enrichGO(

    gene  = gene$ENTREZID,

    keyType = "ENTREZID", 

    OrgDb   = "org.Hs.eg.db",

    ont     = "ALL",

    pAdjustMethod = "BH",

    pvalueCutoff  = 0.05,

    qvalueCutoff  = 0.05,

    readable      = TRUE)

# 再用 setReadable 函数将基因 ID 映射到基因 Symbol

ego2 <- setReadable(ego, OrgDb = "org.Hs.eg.db", 'ENTREZID')

绘制柱状图：

barplot(ego2,showCategory = 20)

5

绘制气泡图：

dotplot(ego2, showCategory = 20)

6

绘制网络图 1：

cnetplot(ego2, showCategory = 3,foldChange=genelist, circular = TRUE, colorEdge = TRUE)

7

绘制网络图 2：

emapplot(ego2, foldChange=genelist, showCategory = 20)

8

KEGG 富集分析

注意这一步需要连接网络，因为 clusterProfiler 是在线抓取新的 pathway 数据库的。当然也有用 kegg.db R 包直接内置数据库的情况，这里不做介绍。

######################KEGG 富集

kegg <- enrichKEGG(

    gene = gene$ENTREZID,

    keyType   = "kegg",

    organism  = 'hsa',

    pvalueCutoff  = 1,

    pAdjustMethod  = "BH",

    qvalueCutoff  = 1,

    use_internal_data = FALSE)

kegg2 <- setReadable(kegg, OrgDb = "org.Hs.eg.db", 'ENTREZID')

绘制柱状图：

barplot(kegg2,showCategory = 20)

9

绘制气泡图：

dotplot(kegg2, showCategory = 20)

10

绘制网络图 1：

cnetplot(kegg2, showCategory = 10,foldChange=genelist, circular = TRUE, colorEdge = TRUE)

11

绘制网络图 2：

emapplot(kegg2, foldChange=genelist, showCategory = 20)

12


五、差异基因热图标记基因

当我们已经用自己的数据做过分析得到了差异基因，或者是已经有自己关注的基因，想用  TCGA & GEO 数据来验证自己的数据或结论的时候，用 TCGA & GEO 数据差异基因热图同时标记特定基因来展示结果就特别合适。

###### 差异基因热图标记关注基因

library("ComplexHeatmap")

library("circlize")

diff_exp = geneexp[rownames(diffgenes),]

# 进行 zscore 归一化

diff_exp_scaled = t(apply(diff_exp, 1, scale)) 

colnames(diff_exp_scaled) = colnames(diff_exp)

# 需要标记的基因

genes = c('CDC20','THRB','FAM13A','CCNA2','PRR15','CHI3L1','CLCA2','ABCA10','A2ML1','LCN2')

## 设置位置

gene_pos = which(rownames(diff_exp) %in% genes)

ha = rowAnnotation(foo = anno_mark(at = gene_pos, labels = genes))

m=round(max(abs(diff_exp_scaled)))

## 画热图

Heatmap(diff_exp_scaled, colorRamp2(c(-m,0,m),c("blue", "#EEEEEE", "red")),

right_annotation = ha,name = "Z-score",show_row_names =FALSE,show_column_names =FALSE)

绘图结果如下：

13

六、单个基因绘图

要在 TCGA & GEO 数据中验证自己的关注的基因的差异情况，除了前面说的差异基因热图标记特定基因之外，也可以对单个基因直接进行绘图。这里我们提供三种展示方式，选择自己喜欢的一种展示形式就行。

用箱线图展示：

## 单个基因箱线图

exp2 = data.frame(t(diff_exp))

exp2$type = group_file$type

ggplot(exp2, aes(x=type, y=CDC20,fill=type)) + 

    geom_boxplot()+geom_jitter(alpha = .3, width =0.2,size=1)+labs(title = "") + ylab("log2 (FPKM)")+ xlab("")+theme_bw()+

  theme(title=element_text(face="bold",size=16),axis.title=element_text(face="bold",size=15),axis.text.x=element_text(face="bold",angle=80,size=13,hjust=1),

  axis.text.y=element_text(face="bold",size=12),legend.text=element_text(face="bold",size=13),legend.title=element_text(face="bold",size=13))

结果如下：

   14

小提琴图展示：

### 单个基因小提琴图

ggplot(exp2, aes(x=type, y=CDC20,fill=type)) + 

    geom_violin(alpha=0.5) + geom_boxplot(alpha = .5,fill="white", width= .2)+labs(title = "") + ylab("log2 (FPKM)")+ xlab("")+theme_bw()+

  theme(title=element_text(face="bold",size=16),axis.title=element_text(face="bold",size=15),axis.text.x=element_text(face="bold",angle=80,size=13,hjust=1),

  axis.text.y=element_text(face="bold",size=12),legend.text=element_text(face="bold",size=13),legend.title=element_text(face="bold",size=13))

结果如下：

15

散点图展示：

### 单个基因散点图   

ggplot(exp2, aes(x=type, y=CDC20)) +

  geom_dotplot(binaxis='y', stackdir='center',binwidth = 0.1)+stat_summary(fun.y=median, geom="point", shape=18,size=3, color="red")+

  theme(axis.title=element_text(face="bold",size=15),axis.text.x=element_text(face="bold",angle=80,size=13,hjust=1),axis.text.y=element_text(face="bold",size=12))

结果如下：

16

这里只展示一个基因的情况，如果是有多个基因需要绘图的，把代码里的基因名替换一下就好了。

好啦，今天的分享就到次为止啦，下次再继续哦！

更多伯豪生物人工服务：

伯豪学院单细胞测序服务人工客服


【返回列表】
上一篇：探索基因表达的空间信息 | 空间转录组测序服务你 Pick 了吗？ 下一篇：scRNA-seq & scATAC-seq 揭示如何刺激新生毛囊促进创面愈合
热门推荐
文献解读 | 单细胞空间转录组联合分析揭示了与胰腺癌预后不良相关的中间态癌细胞群
2024-10-25
Nat Commun| 空间转录组学和单细胞多组学整合分析构建人类胸腺细胞发育空间图谱
2024-10-17
诺奖 C 位 |miRNA 大促 999 元起
2024-10-12
伯优试剂秋冬巨献，优惠不打烊
2024-10-12
爱博泰克和伯豪医学达成战略合作！实现单细胞建库服务提质再升级
2024-10-10
Xenium 亚细胞空间原位分析技术 5K Panel 上线啦！
2024-10-10
高效赋能 | 伯优试剂助力突破细胞研究的新边界
2024-10-09
空间转录组测序全线买三送一
2024-10-08
NC 经典单细胞联合空间转录组研究文章复现培训班，线上开启！
2024-10-01
豪享直播 | 单细胞转录组技术：喉癌微环境与 FFPE 样本测序应用
2024-09-30
单细胞多组学研究一站式解决方案！