背景
在深层皮肤损伤后，哺乳动物的进化为了加速伤口愈合，会产生纤维化疤痕。我们无法再生功能性真皮以及一些功能附属物是人类皮肤伤口愈合的主要障碍。有趣的是，一些组织拥有再生的能力，例如全层切除皮肤伤口后的新生毛囊（HF) 形成已经在小鼠中被证明，这作为一个强大的模型，以了解潜在的皮肤再生机制。哺乳动物的新皮肤修复纤维化瘢痕的形成是由于真皮成纤维细胞占优势，容易产生过量的纤维胞外基质。因此，确定成纤维细胞的来源对于改善伤口愈合效果的治疗至关重要。
长期以来，HF 被认为是伤口愈合过程中再生间充质细胞的潜在来源。事实上，成人 HFs 内真皮干细胞（hfDSCs)，在 HFs 经历反复的变性、重塑和再生周期时，能够不断地用新的间充质干细胞（mesenchymal cells）重新填充 HFs。在这里，作者想知道 HF 相关的间充质祖细胞（mesenchymal progenitors，MPs）是否参与了伤口愈合，以及它们是否代表了新生 HFs 中的诱导间充质干细胞的主要来源。已有研究发现，骨骼肌和心脏中存在 MPs，Hic1 是 MPs 的 maker 基因，在组织损伤后被激活。
摘要
真皮成纤维细胞在稳态时和损伤时的反应表现出相当大的异质性。定义修复性成纤维细胞的谱系起源和促进纤维化或相反地促进毛囊再生的调节程序将对促进伤口愈合效果至关重要。作者发现毛囊间 MPs 对创伤修复的作用有限。相反，以 Hic1 为标志的毛囊间的祖细胞产生了大量的修复性成纤维细胞，并表现出功能分化，介导创面新真皮中心的再生和周围瘢痕的形成。通过 scRNA-seq 发现了独特的转录、调控和上皮 - 间充质转化特征使 MPs 具有再生能力。同时结合 scATAC-seq 突出了再生相关基因座内染色质可及性的变化。针对 RUNX1 和维甲酸信号的药理调节或在创伤激活的成纤维细胞中，同时发现 Hic1 的缺失促进愈合，表明修复性成纤维细胞具有潜在可变化的再生能力。
实验设计
scRNA-seq
为了分离包含创面新真皮的细胞，作者在 Hic1-tdTomato+ 小鼠幼鼠身上创建了小（8 毫米直径）和大（1.5 厘米直径）的全切层伤口。通过流式分选获得 5 个关注的细胞群（1. 小创面 D8 (SWD8) 细胞，2.SWD14, 3.D14 大创面外周细胞，4.D14 大创面中心细胞，5.P28 时期未伤皮肤细胞），即 5 个样本，然后分别上机 10X Genomics 进行 scRNA-seq。
scATAC-seq
分离细胞核用于 10x Chromium Next GEM scATAC -seq 分析，从 D14 大伤口中心区域中收集了 50,000 个细胞，放入 100ml 的冷冻裂解缓冲液中，在冰上抽核，要求无核起泡。使用 CountessTM II 自动细胞计数仪对细胞核进行定量计数，使用 10x Chromium Chip E 对 5000 个细胞核进行捕获，并进行后续的测序。
结果展示
1. 在一定的微环境中，毛囊间成纤维细胞 HE Hic1-Lineage-Comprising HFs 有助于 HFs 再生
2. 单细胞转录组学显示不同的分子程序调节成纤维细胞对损伤的反应
为了剖析在纤维化和再生愈合过程中驱动成纤维细胞分化的分子程序，我们从未受伤的皮肤（P28)、8 和 14dpw 的小伤口和 14dpw 的大伤口（分为中央和外周区域）中分析了 29,269 个单细胞。
作者对大面积创伤对的中心区域细胞单独聚类得到新生 LWC 上层真皮和非新生 LWC 下层真皮。Crabp1+/Prss35+ 成纤维细胞定位于新生 LWC 上层真皮。
这表明，成纤维细胞的空间分离及其与上覆表皮基底细胞的相互作用是获得再生能力所必需的。由于活性成纤维细胞和表皮干细胞之间的上皮 - 间充质细胞的相互作用可启动胚胎皮肤中新生 HF 的形成，作者推断类似的调控相互作用可能建立再生能力，使 WIHN 成为可能。通过使用 CellPhoneDB 将 14 DPW 的 LWC 上层真皮成纤维细胞与 LWC 表皮细胞进行分析发现了一个独特的相互作用体，让人联想到 HF 形态形成过程中的信号交换。例如，ephrin 受体（即 Efna2、Efna4 和 Efnb1) 和配体（即 Epha1、Epha4、Epha5、Ephb2 和 Ephb6) 被认为是胚胎皮肤形态形成过程中表皮增殖的负调节因子（Genander, Holmberg 和 Frise’n, 2010)，预测将在再生的新真皮内相互作用，表明保守调控相互作用的再激活使间充质具有再生能力（图 L)。
3. 在新生毛囊域中表观遗传谱特征可区分成纤维细胞状态
表观基因组可能是再生愈合过程中成纤维细胞功能的关键决定因素，这意味着毛囊间成纤维细胞在早期具有通过表观基因组的改变以重新激活真皮转录状态并获得诱导间充质干细胞对功能的潜在能力虽然转录组的改变可能是皮肤和 HF 再生的必要条件，但不足以激活关键 TFs 的下游靶点。因此作者认为成纤维细胞可能通过调节染色质状态可及性来激活或阻断 TF 活性以调节下游的基因表达。为了直接测试这两种可能性，作者使用 scATAC-seq 检测 LWC 14 dpw 样本的染色质可及性。
上层成纤维细胞可表达 Pdgfra 和 Crabp1 和下层成纤维细胞可表达 Pdgfra 但不能表达 Crabp1。有趣的是，作者发现胚胎活性蛋白多糖 Lum 和代谢调节因子 Prr16 在启动子区对的染色质开放是可表达 Pdgfra 和 Crabp1 的上层成纤维细胞染色质特征的一部分（图 E)。在 579 个差异富集 motif 中，作者发现许多 TFs 被同时在上、下成纤维细胞中预测为具有差异可及性和活性（图 F)。
紧接着作者希望找出 scATAC -seq 和 scRNA-seq 之间的对应关系是否能够揭示毛囊相关的表观遗传特征。作者将 LWC 14 dpw 上层真皮细胞的 scATAC-seq 与 scRNA-seq 进行整合分析。作者的确发现新生的 HF 间充质干细胞的状态有着不同的染色质谱，有助于实现下游精准的转录调控（图 E 和 F)。
例如，Grem2 在 LWC 成纤维细胞的整个基因体上高度可及（图 F)，但伴随 HF 间充质细胞的发生后，其染色质可及性丢失。总之，作者的多组学特性揭示了调控成纤维细胞的上游机制，并列出了其可能作为成功刺激真皮再生和 / 或减轻纤维化的重要分子靶点的关键 TFs。
4. 单细胞多组学显示 Runx1 和维甲酸是间充质细胞再生的主要调节因子
为了评估通过多组学分析鉴定的调控因子的功能意义，作者将维甲酸（RA) 和 Runx1 途径列入了候选名单，因为驱动这些通路的几个 TFs 只在再生 LWC 上层真皮细胞中活跃（Figures BCD)。
为了确定 RA 和 Runx1 信号通路是能激活 WIHN，我们将小分子抑制剂用于伤口愈合实验。图 F 显示 RA 和 Runx1 抑制剂减少了再生毛囊数量。相反，外源性 RA 的应用增加了再生能力，导致新生 HFs 增加 1.5 倍。
为了使确定的候选基因能够广泛传播，作者还建立了一个可搜索的网站，名为 Wound Atlas（(http://www.biernaskielab.ca/wound_atlas）。随着更多数据的积累，这个平台将会定期更新，作者希望能激发对跨组织间充质动力学基因调节的研究。
5. Hic1 缺失通过增加 LWs 再生区域的成纤维细胞密度来增强 WIHN
因为 Hic1 可调节 MP 的状态，其失活导致骨骼肌和心脏损伤后 MP 过度活化，从而导致纤维化，作者想知道 Hic1 是否同样会改变皮肤创面的愈合结果。为了验证，作者构建了 Hic1 缺失的模型。有趣的是，虽然在创伤早期（D2-6)Hic1 失活导致新生 HFs 数量急剧增加 4 倍（图 GHI)、晚期失活（D12-16) 对 WIHN 无影响（图 7K 7M)。
展望
上述研究这支持了这样一种观点，即 Hic1 缺陷本身并不会使成纤维细胞产生亲纤维化反应，相反，当暴露在适当的允许环境中，成纤维细胞却能够适应再生能力。在伤口愈合过程中，短暂调节 Hic1 以更有效地调动皮肤 MPs，并提供一个宽松（即促进促进毛囊再生）的伤口环境，其可能是一种提高伤口愈合效果的可行治疗方法。
（原文链接：https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.07.008）
文章不足
作者将控制性别（female）的生物学重复创伤组织用于 scRNA-seq，这样就排除了对纤维母细胞状态的生物学或性别特异性差异的公正评估。尽管来自 LWC 细胞的 scATAC-seq 比较了再生能力与非再生成纤维细胞，但这样排除了在招募到不同创伤区域（LWC 与 LWP) 或创伤类型（SWs 与 LWs) 的成纤维细胞间差异染色质状态可及性 /motiif 的分析。
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