伯豪学院

10x Genomics 在分析软件这一块还是非常给力的，开发的每个软件都非常好用而且操作简单，特别是安装方便，基本解压后就能用。对于 10x 的空间转录组数据主要用 10x 自己开发的 Space Ranger 来进行前期的处理。

软件下载地址

https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest

可以直接点击下载，也可以用下面的 curl 或 wget 命令下载。

基因组下载

在前面同一个页面往下拉就能看到。

10x 提供了专门的用于空间转录组分析的基因组，目前较新的基因组版本是 2020 年 6 月更新的，基因注释为 Ensembl 98 版本，主要包括人和小鼠。

系统要求

Linux 系统上运行底限要求：

• 8 核 Intel 或 AMD 处理器（建议使用 32 核）

• 64GB RAM（建议 128GB）

• 1TB 可用磁盘空间

• 64 位 CentOS / RedHat 6.0 或 Ubuntu 12.04

集群模式下运行需要额外满足以下要求：

• 每个节点 8 核 Intel 或 AMD 处理器

• 每个内核 6GB RAM

• 共享文件系统（例如 NFS）

• SGE 或 LSF 批处理系统

软件安装

1，解压 SpaceRanger 文件

2，解压参考基因组文件

3，加入环境变量

输入文件准备

Fastq 序列文件

10x 建议测序 read2 设置 90 个碱基的长度 。 从下面 10x 测试的 6 个样本来看，reads 序列长度达到 70bp 以后，mapping 率就不太变化了，有些样本在长度大于 90bp 以后 mapping 率反而下降了。10x 给出这样的建议是考虑到建库后插入片段太短的话，太长的序列里面会包含部分 polyA 甚至 UMI 序列反而影响比对效果。 因为国内目前基本上是测 2x150bp 的，如果建库片段过短比对率较低的话建议将 read2 剪切成 90bp 来分析效果应该会好一点。

Fastq 文件名建议是如下格式的，以免运行报错。

图像文件：

Space Ranger 支持两种样式的显微镜图像：用苏木精和曙红（H&E）染色的明场图像，必须是 24 位彩色 TIFF，16 位灰度 TIFF 或 JPEG。Space Ranger 要求任一方向上的图像至少为 2000 像素。

注意：图像边框的四个角位置是固定的，比如说 三角形在左下角 ，如果扫描出来的图片四个角的位置变了需要先手动调整过来再使用。

软件运行

一般我们拿到的都是直接是 fastq 序列文件了，所以可以直接跑 spaceranger count，不需要再去运行 spaceranger mkfastq 了。

spaceranger count 运行时图片对其有两种方式，一种软件自动识别图片进行对齐，另外一种就是先用 Loupe 软件手动对齐，生成对于 json 文件提供给后面的软件，后期会介绍怎么来手动调整图片。

自动对齐

手动对齐

参数说明：

--Id：结果输出文件夹名称

--Transcriptome：基因组目录

--Fastqs：fastq 文件木兰路

--Sample：原始样本名

--Image：镜像图片文件

--Slide：使用的 10x 芯片型号

--area：样本所在芯片的区域（四通道芯片位置从上到下分别为 A1、B1、C1、D1）

--loupe-alignmen: 图片手动对齐生成的 json 文件，如果是自动对齐不要需要此参数

另外，spaceranger 默认使用系统上可用的所有内核来执行管。可以使用 --localcores 选项来限制使用内核的数量。同理，可以使用 -localmem 来限制使用内存的大小。

结果输出：

成功运行后会到的下面的信息（包括主要的输出文件）