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Cancer Cell 综述│功能基因组学在癌症药物靶点筛选中的应用
发布时间:2020-07-14 浏览次数:6196
随着结构基因组学研究的不断深入,基因组学的研究已经进入结构基因组学时代。结构基因组学主要是在基因组范围内通过人为改变生物体或细胞内基因的序列或表达状态,观察干预后的表型,从而建立基因型与表型间的关联,阐述基因的功能。

文章展示

随着结构基因组学研究的不断深入,基因组学的研究已经进入结构基因组学时代。结构基因组学主要是在基因组范围内通过人为改变生物体或细胞内基因的序列或表达状态,观察干预后的表型,从而建立基因型与表型间的关联,阐述基因的功能。

今年五月底在 Cancer cell 上发表了一篇关于功能基因组学在研究癌症药物靶标领域的综述,概述了癌症药物靶标筛选的不同体系,强调出不同体系之间的优缺点,并对未来癌症研究的工作做出展望。


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这篇综述主要讨论了结合二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)与不同的人为干预基因序列和表达的技术,在筛选癌症药物靶点领域的应用。其筛选策略和相关的技术原理如下图所示:

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功能缺失型筛选

功能缺失型筛选是通过人为下调靶基因的表达水平和功能活性,观察表型的改变,从而鉴定出与特定表型相关的一组基因。

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Cas9 或 Cas12a 核酸酶可通过双链 DNA 断裂和随后目标外显子(即灰色块)内的错义修复引起功能缺失效应;使用 dCas9-BE,可以对目标 DNA 进行化学修饰,在编码序列的特定位点产生终止密码子;通过 CRISPRi 的作用可以抑制转录,dCas9-suppressor 会在基因转录起始位点附近的染色质或 DNA(即蓝色高亮显示的启动子 / 增强子 DNA) 添加抑制标记;病毒载体和转座酶的基因组整合可以将破坏性的转基因添加到编码序列中;mRNA 可以被装载 siRNA 的 RNA 诱导沉默复合物(RISC) 或 gRNA 引导的 Cas13 核酸酶的靶向降解。


功能获得型筛选

功能获得型筛选是通过在细胞内上调靶基因的表达水平,并观测表型改变,建立基因与表型之间的联系,阐述基因功能及相互作用网络。

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功能获得表型可以通过将 dCas9 激活因子融合靶向基因的启动子,经 CRISPRa 技术获得;病毒载体能够随机将组成型表达或诱导表达的 ORFs/cDNA 整合到基因组中;使用病毒载体和转座酶也可以随机整合启动子序列,从而激活附近基因的表达。


功能修饰型筛选

功能修饰型筛选是对目的蛋白的编码基因进行改造,在短时间内获取靶位点氨基酸分别被其他 19 种天然氨基酸所替代的突变子的一种点饱和突变技术。

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基于 dCas9 – BE 介导的编码序列突变,会引起目的蛋白功能活性的改变;引入带有单核苷酸变异(SNVs)的 ORFs 的病毒载体;或引入特定模板结合 Cas9 介导的 DNA 损伤的同源定向修复(HDR) 引入突变。


小编在这里对 RNAi 和 CRISPR 介导的几种筛选体系进行了简单的比较,如下图所示:

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上面所提到的,关于位点插入突变 / 激活筛选技术只适用于在单倍体细胞模型中筛选细胞适合度基因(cellfitness gene)。当然,随着二代测序的发展,这种突变技术的应用能力也将会进一步提升。


那么如何选择点阵式筛选和混合式筛选呢?

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在实验中为了获得更加可靠的结果,往往会将混合式筛选所得到的的基因再通过点阵式文库验证。


怎么选择 Knock down、Knock out 或过表达技术呢?

某些基因 Knock down 后,往往表型不明显,这时候选择 Knock out 会使其表型更加明显。然而对于细胞存活重要的基因,一旦被 Knock out 往往无法观察细胞其他的表型。且对于多拷贝基因,当选用 CRISPR/Cas 体系进行 Knock out 后,会在基因组产生多个双链断裂,过多的 DNA 断裂会导致细胞死亡,增加癌细胞错误筛选的风险,导致假阳性结果,这时候应该优先考虑选择 Knock down 技术。由于基因组的基因存在功能冗余,仅仅下调单个基因的表达,可能无法观察到表型,导致假阴性结果,这时我们可以选择在同一细胞内下调多个基因表达,除了操作难度很大,同时可能会像前面所说的过多的 DNA 断裂会导致假阳性结果的产生。我们也可以选择将功能具有冗余的基因过表达观察表型的改变。此外,在研究特定通路与药物协调作用的机制上过表达筛选技术具有不可以替代的作用。值得注意的是,用过表达技术去验证 Knock down/out 的表型时,同一基因 Knock down/out 的表型与过表达的表型也不总是相反的,可能存在一致的情况,可能是由于目的基因表达的蛋白是以复合物的形式发挥功能。


小结

二代测序技术可高通量地同时对数以万计的 DNA 分子进行测序,并提供大量信息。在混合式筛选的下游,涉及到对富集的细胞亚群内所含 shRNA 或 sgRNA 进行定性和定量分析。NGS 技术的出现,大大加速了这一步骤,并显著降低了成本,很大程度上推动了混合式筛选,减少了从靶标发现到药物开发的时间。

另外,随着 NGS 技术的不断发展,单细胞转录组测序技术也日趋成熟。混合式筛选后所富集到的具有特定表型的细胞经 NGS 后,不仅可以提供细胞群体内 shRNA 或 sgRNA 的丰度信息,而且可以分析单个细胞的转录组。通过将单个细胞内的 shRNA/sgRNA 信息与单细胞转录组数据相结合,使得研究人员可以将特定的基因与细胞转录组发生的改变关联起来,并方便地鉴定到功能上相互关联的一组基因并分析其功能调控网络。

参考文献:Haley Benjamin,Roudnicky Filip,Functional Genomics for Cancer Drug Target Discovery.[J] .Cancer Cell, 2020.


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