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伯豪生物 | 文献解读:不看不行 |IF>11 长什么样?思路清晰的干细胞研究
发布时间:2020-03-16 浏览次数:6519
伯豪生物RNA产品线客户文章:IF>11长什么样?思路清晰的干细胞研究!

RNA 产品应用

Oplr16 通过多能特异性染色体环和 TET2 介导的 DNA 去甲基化来调控干细胞的命运

Oplr16 Serves as a Novel Chromatin Factor to Control Stem Cell Fate by Modulating Pluripotency-Specific Chromosomal Looping and TET2-mediated DNA Demethylation


发表期刊   

Nucleic Acids Research

影响因子

IF=11.15

发表期刊位置

中科院杂志分区 1 区

通讯作者所在单位

吉林大学第一医院

伯豪生物提供的产品或服务

伯豪生物 RNA 测序



研究路线            


图 A 研究路线图


主要结果            

1、确定了 Oplr16 是多能干性相关 lncRNA,进行亚细胞定位,同时证明 Oplr16 是维持干细胞多能性所必需的

潜在的多能性相关的 lncRNA 应满足两个标准能力,首先,具有调节干细胞核心因子基因例如 Oct4,Sox2 和 Nanog 的能力。其次,响应多能性状态而差异表达。本文作者提出了一种新颖的策略来寻找满足这两个标准的潜在 lncRNA。使用染色质 RNA 原位逆转录测序(CRIST-seq)方法确定哪些 lncRNA 与 Oct4 启动子相互作用,然后使用常规的 RNA 转录组测序(RNA-seq)来鉴定可能与多能性重编程相关的差异表达的 lncRNA。RNA-seq 用于鉴定在重编程过程中收集的成纤维细胞和 iPSC 之间差异表达的 RNA。进一步鉴定  Oplr16 是多能性相关的 lncRNA。作者分离了细胞质和核 RNA 进行亚细胞分级测定。RT-PCR 显示,Oplr16 主要位于细胞核中(图 1C)。RNA-FISH 分析也验证了其在 iPSC 中的核定位(图 1D)。这些结果表明 Oplr16 是在体细胞重编程过程中被激活的小鼠核 lncRNA。



为了确定 Oplr16 在多能性中的作用,作者收集了拟胚体分化过程的不同时间的细胞利用用 qPCR 方法,结果发现 Oplr16 与多能性状态呈正相关,在拟胚体分化过程中与 Oct4,Sox2 和 Nanog 具有相似的表达模式。


2、RNA 逆转录相关捕获测序(RAT-seq)

使用 RNA 逆转录相关陷阱测序(RAT-seq)方法来分析 Oplr16 的靶基因。分析显示 Octr16 在 Oct4 基因座富集,在启动子区域有一个峰,对照大鼠在该基因座处未显示结合峰。定量 PCR 也显示 Oplr16 在 Oct4 的启动子区域富集。






3、染色体构象捕获技术(3C)发现 Oplr16 通过招募 SMC1 维持染色质的内环结构

研究团队先前已发现了启动子 - 增强型染色体内环结构,对于启动和维持干细胞多能性至关重要。本研究也使用染色质构象捕获(3C)的方法验证 Oplr16 是否参与该染色质内环,结果检测到 E14 细胞的多能性相关 3C 环,但敲除 Oplr16 可以改变这种染色体内环结构。使用 SMC1 RNA 染色质免疫沉淀(RIP)分析 Oplr16 与 SMC1 相互作用。



4、甲基化分析 Oplr16 招募 TET2 诱导成纤维细胞 DNA 去甲基化并激活 Oct4,增强重编程。

启动子甲基化分析检测 Osclr8 对 Oct4 启动子甲基化是否有保护作用,另通过 RT-PCR 方法检测重编程过程中 3 种 TET 的表达,应用 lncRNA 染色质免疫共沉淀方法检测 TET 蛋白是否与 Oplr16 结合明确 lncRNA Oplr16 与 TET 结合片段。




本文结论            

多能特异性染色质网络的形成是体细胞重编程为多能性状态的关键。研究人员利用“染色质 RNA 原位逆转录测序”(CRIST-SEQ) 分析了与多潜能主控基因 Oct4 相互作用的 RNA 成分,研究发现了核 lncRNA Oplr16 与重编程的启动密切相关。Oplr16 不仅与 Oct4 的启动子相互作用调节其活性,还在重编程为多能性的过程中被特异性激活,激活表达的 Oplr16 是胚胎干细胞维持多能性所必需的,Oplr16 还能促进成纤维细胞重编程为多能细胞。RNA 逆转录相关的 TRAP 测序(RAT-SEQ) 结果表明,Oplr16 与多个与干细胞自我更新相关的靶基因相互作用。Oplr16 利用其 3’端片段招募染色质因子 SMC1 来调控多能特异性染色体内环结构的形成。在与 Oct4 启动子结合后,Oplr16 招募 TET2 诱导成纤维细胞 DNA 去甲基化并激活 Oct4,增强重编程。这些研究数据表明 Oplr16 作为一个关键的染色质因子可能通过调节染色质结构和 DNA 去甲基化来调控干细胞的命运。


微信原文:https://mp.weixin.qq.com/s/eZaKiF5l4aKOv-o2i-6NhA

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