技术简介

5hmC，作为 5- 甲基胞嘧啶（5mC）的氧化产物，是 DNA 甲基化修饰动态调控过程重要的中间产物。5hmC 主要富集在基因的转录起始位点，转录终止位点和基因远端区域的上游和下游。已有研究报道 5hmC 与癌症、神经退行性疾病等有关。2017 年，《Cell Research》上连续发表了两篇使用芝加哥大学何川教授设计并优化的 5hmC 富集测序技术，验证 5hmC 在肿瘤临床应用的文章。

技术原理

第一步：5hmC 信号捕获，通过化学标记捕获技术可特异性富集全基因组近 2 万个含有 5hmC 修饰的基因片段。

第二步：二代测序，对富集到的基因片段进行二代测序，获得全基因组 5hmC 的分布和含量。

第三步：生成数据与发送报告。

技术应用

羟甲基化作为去甲基化过程中的中间产物，目前多用于疾病生物标志物的筛选，预测预后。

伯豪优势

特异性检测羟甲基化：5-hmC 抗体能够区分甲基化和羟甲基化信号，特异性的检测羟甲基化区域。

灵活度高：能够直接对任意物种的高羟甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息。

检测范围广：覆盖整个基因组范围的羟甲基化区域。

精度高：能够在实际结合位点 50 个碱基范围内定位。

数字化信号：直接对羟甲基化片段进行测序和定量，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

上海伯豪生物本次推出的 5 - 羟甲基化检测服务技术与何川教授发表在 Nature Biotechnology 上的技术一致。目前为止，该技术已经在 10000+ 例样本上得到了应用

样本要求

样品类型：gDNA，组织，细胞

样品纯度：OD 260/280 值应在 1.8～2.0 之间；RNA 应去除干净；

样品浓度：使用 Qubit 准确定量 DNA 浓度

样品总量：每个样品 DNA 起始总量不少于 1ug。

分析流程

案例展示

案例一：小鼠胚胎干细胞的羟甲基化研究

研究背景

黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是一种从黑色素细胞发展而来的癌症，是皮肤癌中罕见的癌症。好发于皮肤但也可能出现在口腔、肠道或眼睛中。女性患者的黑色素瘤常出现在腿，而男性患者则常出现在背部。有时黑色素瘤是由痣转变发展而来，有这种转变的痣外观上的改变包括尺寸变大、边缘变得不规则、颜色改变、发痒、或皮肤破坏。

黑色素瘤是皮肤癌当中危险的一种，其恶性程度高，是皮肤癌的主要死亡原因之一。而且放射治疗与化学治疗改善程度都很有限，因此死亡率很高，若能早期诊断治疗可以提高治愈率。

研究思路

研究结果

研究者先用免疫组化的方法证明黑色素瘤组织相比正常痣，其羟甲基化程度降低，结合临床数据证明 DNA 羟甲基化水平可以作为黑色素瘤的预后标志物。然后对 70 例病人的 DNA 羟甲基水平采用 hMeDIP-seq 的方法进行检测，在全基因组范围内研究黑色素瘤羟甲基化变化的分布位点。建立动物模型实验找到了黑色素瘤中整体羟甲基化水平降低的根本原因。

参考文献

Wu H, et al. Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Genes Dev. 2011 Apr 1;25(7):679-84.

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