伯豪学院

文章标题：Oncolytic virotherapy-mediated anti-tumor response: a single-cell perspective

发表期刊：Cancer Cell

影响因子：31.74

文章导读

所有疾病中，肝癌致死率第三，而肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma , HCC）约占所有肝癌发病率的 90%。尽管现免疫疗法对多种肿瘤适应症有临床益处，但肝癌的应答率却低得多，因此明确肝癌微环境中免疫细胞的动态变化特征对于提高免疫治疗效果至关重要。本文结合两种单细胞 RNA 测序技术（10x Genomics 和 SMART-seq2），从肝癌组织和其他 4 个免疫相关部位分离 CD45+  细胞进行单细胞测序，生成了 HCC 单细胞免疫图谱，并且初次系统地探索和比较了 HCC 肿瘤、邻近肝脏、肝淋巴结 (LN)、腹水和血液中免疫细胞的细胞组成、功能状态、发育轨迹和细胞相互作用，使我们对 HCC 免疫微环境的动态变化有了更深层的理解。

科学问题

肿瘤微环境（TME）的细胞成分高度复杂，髓细胞和淋巴细胞在炎症、肿瘤免疫逃避和免疫治疗反应中发挥重要作用。TME 中髓细胞的存在通常与患者生存率的改变有关。据报道，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可阻止 T 细胞识别和杀伤肿瘤细胞；在小鼠模型中，传统树突状细胞（DC）亚群（cDC1 和 cDC2）迁移到肿瘤引流淋巴结和原始 CD8+ 或 CD4+  T 细胞。然而，肝细胞癌患者 TAM 和 DC 亚群的特征和功能尚不清楚。作者之前已经通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）对肝癌中的 T 细胞进行了表征，但总体免疫图谱仍然未知。

实验分组

16 名未接受治疗的肝癌患者的癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水中分选的 CD45+  免疫细胞

实验关键技术：10x Genomics，SMART-seq2

1. HCC 免疫细胞图谱

作者选取 16 名肝癌患者癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水中分选的 CD45+  细胞，分别使用 10x Genomics 和 SMART-seq2 两种方法进行单细胞测序，将 10x 产生的 66,187 个细胞和 SMART-seq2 产生的 11,134 个细胞数据整合聚类，揭示了 HCC 中的主要免疫细胞类型，包括 T 细胞、NK 细胞、髓细胞、B 细胞、浆细胞和 ILC。T、NK 和骨髓细胞进一步细分，分别产生 14、9 和 14 个亚群。进一步分析细胞组成发现，免疫细胞类型表现出不同的组织偏好，T 细胞中，调节性 T (Treg) 细胞和耗竭的 CD8+ T (Tex) 细胞，增殖性 T 细胞，在肿瘤中富集，而髓系细胞主要在腹水中富集。

2. 腹水中的淋巴细胞和髓细胞起源不同

为探究腹水中细胞的潜在起源，作者假设腹水中的免疫细胞是从其他组织中积累的。分析发现，骨髓细胞主要映射到肿瘤细胞，淋巴细胞主要映射到血液、肿瘤和邻近肝脏中，而在腹水中富集的亚群 Mφ-c5-VCAN 和 Mφ-c6-MARCO 主要映射到肿瘤衍生细胞。基于线粒体突变的谱系追踪结果显示，肿瘤组织和腹水中的细胞具有共同谱系。

随后作者研究了腹水和其他组织中巨噬细胞的关系。基于线粒体突变的系统发育树和 RNA 速度分析显示腹水中的淋巴细胞和巨噬细胞的特定亚群可能源自肿瘤，巨噬细胞存在从肿瘤到腹水的迁移过程。

3. 肿瘤中的巨噬细胞呈现两种不同的状态（TAM-like 和 MDSC-like)

对巨噬细胞重新聚类，共细分为 6 个巨噬细胞簇，其中 Mφ-c1-THBS1 和 Mφ-c2-C1QA 在肿瘤组织中富集，根据基因的整体表达情况确定 Mφ-c1-THBS1 为 MDSC 样巨噬细胞，Mφ-c2-C1QA 为 TAM 样巨噬细胞。生存分析结果显示，TAM 样巨噬细胞与不良预后相关。TAM 样细胞的两个特征基因 SLC40A1 和 GPNMB 此前也被报道与不良预后相关。因此，作者使用 CRISPR-Cas9 技术敲除了 THP- 1 单核细胞来源巨噬细胞的 SLC40A1 或者 GPNMB 基因，结果证实 GPNMB 促进巨噬细胞产生 TNF-α，而 SLC40A1 促进促炎细胞因子但抑制 IL1β 的产生，暗示 TAM 样巨噬细胞可能在炎症反应中起重要作用。

4. LAMP3+ DCs：在肿瘤中具有潜在迁移能力的成熟 DCs

随后，作者将研究重点集中在肿瘤中富集的 DC 亚群。根据基因表达情况，确认 DC-C1-CD1C 为 cDC2，DC-C3-CLEC9A 为 cDC1，而 DC-c4-LAMP3 不同于已知的 DC 亚型，表达成熟标记和迁移标记。据报道 LAMP3 与 CD40L 刺激下的 DC 成熟有关，因此作者进一步检查了 LAMP3+ DC 与其他 DC 亚群之间的关系。经体外刺激实验和 scRNA-seq 分析，结果证实体外成熟刺激诱导 LAMP3+ DCs 的产生。此外作者还发现了 3 个特殊的亚群：C07，对应 cDC2 到 LAMP3+ DCs 之间的过渡阶段，而 C09 和 C10，对应 pDCs 和 LAMP3+ DCs 之间的过渡阶段，处于过渡阶段（C07 和 C09）的细胞表现出向 LAMP3+ DCs 的强烈定向流动。迁移能力分析结果显示，在 LAMP3+ DC 中，肿瘤衍生细胞表现出向 LN 中细胞的定向流动。综上，本次分析确认乐 HCC 中具有成熟特征的 LAMP3+ DCs，这些细胞可能源自 cDC1 和 cDC2，并表现出向 LN 迁移的能力。

5. DCs 与淋巴细胞的相互作用关系

为了研究骨髓细胞和淋巴细胞之间的相互作用，作者通过分析免疫相关的配体 - 受体（LR）对以深入了解细胞簇之间的调节关系。结果显示，肿瘤组织中的 DC 亚群通过 CD28/B7 家族和白细胞介素 -15，与 Tex 细胞、增殖性 T 细胞与 Treg 细胞相互作用。LAMP3+ DCs 在三个 DC 亚群中表现出高的配体数量，可通过迁移趋化因子吸引 T 细胞，利用 CD274/PDCD1LG2-PDCD1 轴来调节多种类型的 T 细胞，并可能与 T 细胞功能障碍有关。

参考文献：

1. Zhang Q, He Y, Luo N, et al (2019) Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell 179:829-845.e20. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.003.