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蛋白篇│蛋白组学机制研究例文解读
发布时间:2020-05-22 浏览次数:6620
我们以前熟悉的研究,往往从转录组起始,测得转录组数据后,寻找差异表达显著的基因。然后,分别有生物标志物方向和机制研究方向,两种套路成文。蛋白组学也有类似的套路。今天,招财猫讲述的文章是机制研究方向的。我们来看下吧!

上一回,招财猫讲述了蛋白质检测的几种常用方法,基于质谱技术的 label free、iTRAQ/TMT、DIA、PRM 以及基于免疫技术的液相悬浮芯片。这一回,招财猫来讲述一篇蛋白组学的文章。

我们以前熟悉的研究,往往从转录组起始,测得转录组数据后,寻找差异表达显著的基因。然后,分别有生物标志物方向和机制研究方向,两种套路成文。蛋白组学也有类似的套路。今天,招财猫讲述的文章是机制研究方向的。我们来看下吧!


文章展示

 

文章如上,我们一看标题就知道是机制方向:XX 基因导致某种疾病进展(恶化∕好转),通过 XX 通路。本文研究的疾病是黑素瘤(melanoma),关注的点是黑素瘤转移(melanoma metastasis)。


研究思路

首先,样本是建立的转移细胞株。图 1 说明细胞系建立方法,并验证了一些关键的指标证明细胞系已建立。建立方法是将小鼠黑色素瘤细胞系 B16F10,及人黑色素瘤细胞系 A375 通过尾静脉注射进小鼠体内,取肺转移组织,取原代细胞进行培养,得到相应的转移细胞株 B16F10M 和 A375M。下图展示了形态(伪足形态),并表达了更高的增殖细胞核抗原(PCNA),证明构建是成功的。

 

图 1

然后,取细胞株 B16F10 和 B16F10M,进行 iTRAQ 蛋白定量检测。发现,转移性 B16F10M 细胞株中 WDR74 的表达较对照组 B16F10 细胞株增加(差异倍数 =2.25,p<0.01)。然后用 qPCR 验证了 RNA 水平上、免疫印迹验证蛋白水平上的 WDR74,在两种细胞中,WDR74 确实存在差异表达——招财猫说,这次 RNA 水平和蛋白水平一致了,没有落入那“60%”里面去(有了 RNA-seq,,还需要蛋白质检测吗?)。

 

图 2

在真实组织里也检测了 WDR74 的表达,结果显示,从正常皮肤发展到痣到原发性黑色素瘤再到转移性黑色素瘤,WDR74 的表达是不断增加的(图略)。

到此,由高通量的蛋白组学方法(本文是 iTRAQ)筛选到了 WDR74,然后由低通量的 qPCR 和免疫印迹验证表达。所以我们的目标分子选定了,下面就是进行功能研究了。


细胞实验

采用 A375 细胞系,对 WDR74 进行过表达和敲除,其中敲除采用的是 CRISPR/Cas9 方法,具体介绍请见招财猫以前的文章(CRISPR∕Cas9 基因编辑技术),然后检测了细胞表型,这里检测的是细胞周期、增殖、凋亡、转移和侵袭(基本把所有细胞表型都做了)。结果表明,WDR74 在 A375 细胞中,能促进细胞周期的进展和细胞增殖,并抗细胞凋亡——是的,逻辑上与之前的病理结果相符,将 WDR74 与黑素瘤转移的相关性,进一步证明为因果关系(原文图 2、3)。


机制研究

本文的思路是,发掘前期的研究结果,联系本次发现的新分子。前期的众多研究显示,在多种肿瘤中,肿瘤的进展与 RP–MDM2–p53 通路相关。那么 WDR74 是否也与此通路相关?还是采用 A375 的 WDR74 过表达和敲除细胞株,先关注一下通路蛋白在过表达和敲除细胞株里的表达变化,进行 Western Blot。结果表明,p53、MDM2、RPL5 的表达量,都与 WDR74 的表达量相关,并且,p53 的下游基因,VEGFA、caspase 等,也都与 WDR74 的表达量相关。

 

图 3

机制还需要证明相互作用。作者证明,WDR74 对于 p53 和 MDM2 的结合是必需的。

 

图 4

作者还进行了拯救实验,在已建立的 WDR74 的过表达和敲除稳定株的基础上,转入了 p53、MDM2 的 siRNA,然后检测各相关分子的表达,及细胞的增殖。这些结果要与前面的单 WDR74 的过表达及敲除稳定株的结果相比,表明了上下游的逻辑关系——在此分子上游的仍受 WDR74 影响,在此分子下游的不受 WDR74 影响。图 F 证明了 p53 是位于通路的下游,切断 p53 这环就切断了 WDR74 对细胞的影响。图 G 表明 RPL5 是 MDM2 的上游,p53 是 MDM2 的下游。

 

图 5

机制图

根据以上逻辑关系,作者画了一个机制图:

 

图 6

动物实验

在裸鼠中,注射 WDR74 的过表达和敲除稳定株进行成瘤实验。结果表明,WDR74 促进了黑素瘤瘤体生长和远端转移。原文图 6。


文章点评

招财猫点评:从这个文章的套路看来,此蛋白组的机制文章与转录组的机制文章基本一样,都是用组学进行筛选,低通量验证选取的蛋白的表达,然后选取特定基因,进行功能研究。功能研究,还是我们原来讲过的那套方法,过表达和敲除,在细胞模型中检测表型,验证机制,在动物模型中进一步验证表型。

总之,本文结构非常完整,并且中规中矩,算是一篇还不错的文章。要使文章 blingbling 地闪闪发亮,似乎做到这种程度还不够。要怎样才可以呢?请跟紧招财猫,后续介绍!


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