上一回，招财猫讲述了蛋白质检测的几种常用方法，基于质谱技术的 label free、iTRAQ/TMT、DIA、PRM 以及基于免疫技术的液相悬浮芯片。这一回，招财猫来讲述一篇蛋白组学的文章。
我们以前熟悉的研究，往往从转录组起始，测得转录组数据后，寻找差异表达显著的基因。然后，分别有生物标志物方向和机制研究方向，两种套路成文。蛋白组学也有类似的套路。今天，招财猫讲述的文章是机制研究方向的。我们来看下吧！
文章展示
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文章如上，我们一看标题就知道是机制方向：XX 基因导致某种疾病进展（恶化∕好转），通过 XX 通路。本文研究的疾病是黑素瘤（melanoma），关注的点是黑素瘤转移（melanoma metastasis）。
研究思路
首先，样本是建立的转移细胞株。图 1 说明细胞系建立方法，并验证了一些关键的指标证明细胞系已建立。建立方法是将小鼠黑色素瘤细胞系 B16F10，及人黑色素瘤细胞系 A375 通过尾静脉注射进小鼠体内，取肺转移组织，取原代细胞进行培养，得到相应的转移细胞株 B16F10M 和 A375M。下图展示了形态（伪足形态），并表达了更高的增殖细胞核抗原（PCNA），证明构建是成功的。
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图 1
然后，取细胞株 B16F10 和 B16F10M，进行 iTRAQ 蛋白定量检测。发现，转移性 B16F10M 细胞株中 WDR74 的表达较对照组 B16F10 细胞株增加（差异倍数 =2.25，p<0.01）。然后用 qPCR 验证了 RNA 水平上、免疫印迹验证蛋白水平上的 WDR74，在两种细胞中，WDR74 确实存在差异表达——招财猫说，这次 RNA 水平和蛋白水平一致了，没有落入那“60%”里面去（有了 RNA-seq,，还需要蛋白质检测吗？）。
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图 2
在真实组织里也检测了 WDR74 的表达，结果显示，从正常皮肤发展到痣到原发性黑色素瘤再到转移性黑色素瘤，WDR74 的表达是不断增加的（图略）。
到此，由高通量的蛋白组学方法（本文是 iTRAQ）筛选到了 WDR74，然后由低通量的 qPCR 和免疫印迹验证表达。所以我们的目标分子选定了，下面就是进行功能研究了。
细胞实验
采用 A375 细胞系，对 WDR74 进行过表达和敲除，其中敲除采用的是 CRISPR/Cas9 方法，具体介绍请见招财猫以前的文章（CRISPR∕Cas9 基因编辑技术），然后检测了细胞表型，这里检测的是细胞周期、增殖、凋亡、转移和侵袭（基本把所有细胞表型都做了）。结果表明，WDR74 在 A375 细胞中，能促进细胞周期的进展和细胞增殖，并抗细胞凋亡——是的，逻辑上与之前的病理结果相符，将 WDR74 与黑素瘤转移的相关性，进一步证明为因果关系（原文图 2、3）。
机制研究
本文的思路是，发掘前期的研究结果，联系本次发现的新分子。前期的众多研究显示，在多种肿瘤中，肿瘤的进展与 RP–MDM2–p53 通路相关。那么 WDR74 是否也与此通路相关？还是采用 A375 的 WDR74 过表达和敲除细胞株，先关注一下通路蛋白在过表达和敲除细胞株里的表达变化，进行 Western Blot。结果表明，p53、MDM2、RPL5 的表达量，都与 WDR74 的表达量相关，并且，p53 的下游基因，VEGFA、caspase 等，也都与 WDR74 的表达量相关。
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图 3
机制还需要证明相互作用。作者证明，WDR74 对于 p53 和 MDM2 的结合是必需的。
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图 4
作者还进行了拯救实验，在已建立的 WDR74 的过表达和敲除稳定株的基础上，转入了 p53、MDM2 的 siRNA，然后检测各相关分子的表达，及细胞的增殖。这些结果要与前面的单 WDR74 的过表达及敲除稳定株的结果相比，表明了上下游的逻辑关系——在此分子上游的仍受 WDR74 影响，在此分子下游的不受 WDR74 影响。图 F 证明了 p53 是位于通路的下游，切断 p53 这环就切断了 WDR74 对细胞的影响。图 G 表明 RPL5 是 MDM2 的上游，p53 是 MDM2 的下游。
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图 5
机制图
根据以上逻辑关系，作者画了一个机制图：
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图 6
动物实验
在裸鼠中，注射 WDR74 的过表达和敲除稳定株进行成瘤实验。结果表明，WDR74 促进了黑素瘤瘤体生长和远端转移。原文图 6。
文章点评
招财猫点评：从这个文章的套路看来，此蛋白组的机制文章与转录组的机制文章基本一样，都是用组学进行筛选，低通量验证选取的蛋白的表达，然后选取特定基因，进行功能研究。功能研究，还是我们原来讲过的那套方法，过表达和敲除，在细胞模型中检测表型，验证机制，在动物模型中进一步验证表型。
总之，本文结构非常完整，并且中规中矩，算是一篇还不错的文章。要使文章 blingbling 地闪闪发亮，似乎做到这种程度还不够。要怎样才可以呢？请跟紧招财猫，后续介绍！
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