标题：Single-Cell Analyses Identify Brain Mural Cells Expressing CD19 as Potential Off-Tumor Targets for CAR-T Immunotherapies
期刊： Cell
影响因子：36.13
导读
CD19 导向的免疫疗法在临床上对治疗 B 细胞恶性肿瘤有效，但也会引起高发生率的神经毒性。使用嵌合抗原受体（CAR) T 细胞或双特异性 T 细胞受体（BiTE) 抗体治疗的患者部分伴有严重的神经毒性，包括与 T 细胞渗入大脑致命的脑水肿。在这里，作者报道了包围内皮细胞的壁细胞表达 CD19，它对血脑屏障的完整性至关重要。作者利用单细胞 RNA-seq 数据鉴定了 CD19 在脑壁细胞中的表达，并在蛋白水平上得到了证实。随着壁细胞谱系的出现，大脑中 CD19 的表达在发育早期就开始了，并贯穿整个成年期的大脑区域。小鼠壁细胞显示 CD19 表达水平较低，提示临床前神经毒性动物模型存在局限性。本研究揭示 CD19 靶向治疗中神经毒性的机制，并突出了人类单细胞图谱在设计免疫疗法中的应用。
科学问题
CD19 靶向治疗中神经毒性的机制？
实验设计
2364 人前额叶皮层细胞的 scRNA-seq 数据
实验思路
实验结果
单细胞 RNA 测序数据鉴定表达 CD19 的壁细胞
作者首先分析了 2364 人前额叶皮层细胞的 scRNA-seq 数据（Zhong 等人，2018 年），图 1A)。作者将细胞聚集在一起，并确定了广泛的群体，随后重点分析了非神经元、非红细胞细胞。这些细胞进一步分化为星形胶质细胞、淋巴细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞前体、内皮细胞和周细胞（图 1B、1C 和 S1A)。根据表达标记基因对这些群体进行了鉴定；壁细胞特异表达预期的标记基因，如 PDGFRB、FOXF2、RGS5 和 CD248，而内皮细胞表达一组独特的标记基因，包括 CDH5 和 PECAM1 (CD31; 图 1 d)。另外，发现一小群表达 CD19 的壁细胞（共同表达 CD248）。
▲图 1
两个独立数据集对壁细胞 CD19 表达的确认
接下来，作者试图在额外的独立 scRNA-seq 数据集中重现这一观察结果。在来自人类前脑的数据集（La Manno et al.，2018) 中，标记 CD248 和 RGS5 阳性的壁细胞群（48/7906 细胞）也显示 CD19 表达（12/48 细胞有可测量的 CD19)，B 细胞标记 CD79A 缺失（图 2A)。在来自人类前脑腹侧（La Manno et al.，2016) 的第三个数据集中，作者再次观察到 CD248 阳性壁细胞群体中 CD19 的表达（195 个壁细胞 /1977 细胞，其中 25/195 有可测量的 CD19; 图 2 b).
▲图 2
人脑 CD19 的免疫组化
为了评估人类壁细胞中 CD19 蛋白的表达，作者使用临床验证的抗人 CD19 抗体（克隆 BT51E) 对健康死亡受试者的样本进行了人类大脑几个区域的免疫组化。研究发现 CD19+ 壁细胞的频率可能存在异质性，这可以解释临床观察到的神经毒性在患者之间的严重程度差异（图 3）。
▲图 3
周细胞和 vSMCs 分析显示 CD19 在壁细胞中表达。
通过分析周细胞和 vSMCs 的转录组，分析显示，CD19 高度表达的神经与血管的 meta-cell 集群，符合作者之前的结果（图 4 c D)。作者能够清楚地区分未分化的祖细胞和分化的壁细胞，这表明一旦壁细胞出现，它们就会表达 CD19(图 4E F)。
▲图 4
CD19 在周细胞和 vSMCs 中都有表达
作者使用来自 BICCN 数据集的细胞重复了这个分析，对非神经元亚群（壁细胞、内皮细胞和小胶质细胞）进行重新分析和聚类，以区分 NVU 细胞类型的转录差异（图 5A B)。作者观察到这些细胞显示出强富集的周细胞标志物，如 ABCC9 和 KCNJ8，不富集 ACTA2 或其他 vSMC 标记基因，表明它们代表真实的周细胞（图 5C)。另外发现 CD19 也在 vSMC 群体中表达。这表明 CD19 的表达并非周细胞所特有，而是人类大脑壁细胞的共同特征，与 IHC 观察到的染色模式一致（图 3)。
▲图 5
CAR- T 细胞识别的 CD19 亚型在成人人脑中表达
为了探究周细胞中的 CD19 表达是否也存在于成人样本中，作者使用了 Allen Institute Brainspan Project 生成的横跨人类年龄和大脑区域的 RNA 测序数据。作者首先确认了 CD19 在产前和产后样本中表达水平相似，并且在不同脑区样本中也有表达（图 6A)。分析发现 CD19 在成人大脑中的表达主要是壁细胞丰度的结果，而不是 B 细胞丰度的结果。
▲图 6
人脑 CD19 的壁细胞特异性表达
研究对脑周细胞、肺周细胞和 vSMCs 进行了对比分析，作者发现了大脑和肺周细胞之间的许多转录差异（图 7A, S7A)。值得注意的是，CD19 在大脑中特异表达。作者探索了定位于细胞膜或细胞表面的基因是否在相对于肺周细胞和 B 细胞的 NVU 中有差异表达，并可用于提高 CD19 CAR- T 的安全性（图 7B C)。
▲图 7
参考文献：
Parker Kevin R,Migliorini Denis,Perkey Eric et al. Single-Cell Analyses Identify Brain Mural Cells Expressing CD19 as Potential Off-Tumor Targets for CAR-T Immunotherapies.[J] .Cell, 2020, 183: 126-142.e17.
