越来越多的证据表明，阿尔茨海默氏病（AD) 是一种普遍的代谢性疾病，发病机理涉及多种生化途径的失调。目前对 AD 的治疗方法为抗淀粉样 β(Aβ) 蛋白疗法，但是该方法治愈率低。所以确定 AD 发病机制的新靶点对于开发有效的治疗方法至关重要。过去的研究表明，胆碱相关生化途径的异常可能与阿尔茨海默病的发病机制有关，特别是转甲基化、多胺合成 / 分解代谢和相关途径。本文研究者检验了大脑中胆碱相关的生化途径失调与 AD 发病机制有关的假说；他们在以下 6 个类别中研究了与转甲基化和多胺合成 / 分解代谢相关的生化反应中的代谢物：蛋氨酸循环，转硫和谷胱甘肽合成，多胺合成 / 分解代谢，尿素循环，谷氨酸 - 天冬氨酸代谢和神经递质代谢，利用毛细管电泳质谱法（CE-MS) 对这些类别中可用的代谢物进行分析。然后利用 GEO 中的转录组数据集以检验这些通路的遗传调节因子的基因表达是否在已知 AD 病理积累触发认知障碍发作的大脑区域发生了变化。
实验方法
样本组织：人脑组织【大脑区域：颞下回（ITG)，额中回（MFG)，小脑（CB)】
检测方法：靶向代谢组检测
检测平台：CE-MS
样本分组：分为 3 组，分别为 AD 组（n=17）、ASY 组（n=13）、CN 组（n=13）
分析流程
1. CE-TOFMS data(n=43) 进行靶向代谢组分析，筛选差异代谢物。
2. 通过 GEO datasheet【内嗅皮层（ERC) 区：AD 组 =25,CN 组 = 52; 海马（HIP) 区：AD 组 =29,CN 组 =56】验证通路中调节因子的基因表达的变化情况。
主要结果
代谢组分析
研究者通过取得捐赠者的脑组织进行靶向代谢的定量检测，从 130 种可定量的代谢物中预先确定了 27 种差异代谢物，它们代表了转甲基化和多胺途径中的反应物，其中由于 1 个代谢物的 Missing value 超过 30%，所以被剔除。检测结果如表 1(仅显示 9 个代谢物的信息）。26 种差异代谢物涉及的生化途径一共 6 条：蛋氨酸循环、转硫和谷胱甘肽合成、多胺的合成和分解代谢、尿素循环、谷氨酸 - 天冬氨酸代谢、神经递质代谢。
表 1 CE-TOFMS 检测的局部脑组织代谢物浓度（pmol/mg)
研究者采用 R -Studio1.1.453 和 STATA16.0 软件进行分析。使用 α 值 0.05 来确定统计学意义。同时进行了多重比较方法 Benjamini-Hochberg 错误发现率（FDR=0.05）和 bonferoni 校正（FWER=0.05）。两种比较方法均校正了 52 种比较（26 种代谢物×2 个主要脑部区域 ITG 和 MFG），这些比较是基于它们对不同 AD 病理的易感性而预先指定的。检查了三组（AD，ASY 和 CN）在性别，APOEε4 携带者状态（Fisherexact 试验），年龄和验尸间隔（PMI）（Kruskal-Wallis 测试）方面的差异样。信息如表 2：
表 2 BLSA 尸检样本的人口统计学特征
本研究的主要分析不同组之间代谢物水平的差异，研究者在两个主要大脑区域 ITG,MFG 以及次级控制区域 CB 中的预先定义代谢物类别用线性混合效应模型，其中以 log2 转换浓度作为因变量，组作为固定效应，非结构化的组内残差相关性，Huber-White 稳健方差估计，然后使用的相同的方法，仅针对主要大脑区域（即 ITG 和 MFG），分析脑组织代谢物与 Braak 和 CERAD 病理评分的相关性。利用广义估计方程（GEE）聚类分析和独立 Kruskal-Wallis 检验的非参数 Spearman 相关进行敏感性分析，得到了相似的结果（图 1 -3）。
图 1 为可视化代谢物变化方向和影响大小的森林图。表明不同组之间的显著代谢物浓度差异。图 2 显示了代谢物浓度和神经斑块负荷（即 CERAD 评分）之间的关联。图 3 显示了代谢物浓度和神经原纤维病理学（即 Braak 评分）之间的关联。图 1 - 3 中绿色表示 AD 中代谢物浓度较低，与 AD 病理呈负相关；红色表示表示 AD 中代谢物浓度较高，与 AD 病理呈正相关。
图 1 类别特异性代谢物浓度的组间差异
图 2 类别特异性代谢物与神经症性斑块负荷（CERAD) 的关联
图 3 特定类别代谢物与神经原纤维病理学（Braak）之间的关联
基因表达分析
表 2 列出了在三个 GEO 数据集中有基因表达数据的参与者的人口统计学特征。在 GEO 数据中，AD 参与者明显比 CN 参与者年龄大（p<0.05)。BLSA 参与者和 GEO 参与者没有性别差异；BLSA 参与者明显比 GEO 参与者年龄大（p<0.05)。
表 3 来自 GEO 数据的参与者人口统计
对于基因表达数据，首先使用 Robust Multi-array Average(RMA) 和 Brainarray ENTREZG（version 22）自定义 CDF 对样本进行归一化。利用 GEO 数据集 GSE48350、GSE5281 和 GSE8442，并使用 GEO 数据集名称对所有的批次协变量进一步统计分析。然后使用 one-way ANOVA test 测试 AD 和 CN 样本在性别、年龄和批次上的差异。利用 R 包 limma 检测 AD 和 CN 样本之间的单个基因的单变量差异，控制性别、年龄和批次的影响，并使用 FDR(p=0.05) 调整 GEO 数据集中使用的 Affymetrix U133 Plus 2.0 数组中的所有的 20414 个基因的多重比较。总结了性别、年龄和成批校正的倍数变化结果。
为了确认 ERC 和 HIP 中的区域基因表达与进行代谢组学测定的 ITG 和 MFG 中的基因表达相关性，研究者检测了在颞下和中额叶皮层中检测的 71 个基因中的区域基因表达变化，ITG 中的区域基因表达与 HIP 区（p=0.455,p=5.9×10-5) 和 ERC(p=0.260,p=0.0276) 显著相关，MFG 中的区域基因表达也显著相关（HIP 区 p =0.512，p=4.19×10-6;ERC 区：p=0.344,p=0.0031）。
甲基化和多胺途径相关的生化反应的六个类别中的 33 个基因（FDR 校正的 p 值 <0.05）中，AD 和 CN 的 ERC /HIP 区域的基因表达水平发生了变化。使用 FDR 校正多次后，AD 和 CN 样品之间基因表达的这些差异具有统计学意义，与 CN 相比，图 4 总结了 AD 患者的 HIP/ERC 中与转甲基化和多胺代谢相关的所有六类生化反应的差异表达基因。灰色表示 AD 患者和对照组的基因表达没有显著差异。
图 4 ERC 和海马区差异基因表达热图
特定代谢途径中代谢物浓度和基因表达变化
本研究者先前的研究表明了 AD 中的糖酵解、脂肪酸和磷脂代谢的异常，本研究则发现了研究了转甲基化途径（一碳单位的主要代谢来源）和密切相关的多胺合成 / 分解代谢途径的失调与 AD 的发病相关。包括神经递质信号、尿素循环、天冬氨酸类谷氨酸代谢和谷胱甘肽合成的异常。（研究者将 ITG 组差异的主要结果在特定的生化途径中）
1. 蛋氨酸循环 ITG 中 AD 组胆碱浓度较低（p=0.003)，SAM 浓度较高（p=0.005)。与 CN 相比，AD 海马 /ERC 中 CHDH、BHMT2、SHMT1 和 MAT1A 基因表达增加，MTR、AHCY 和 MTHFD1 基因表达降低。
2. 转硫法与谷胱甘肽合成 ITG 的 AD 患者半胱氨酸（P<0.001*) 和谷胱甘肽浓度（P<0.001*) 较高。与 CN 相比，AD 组海马 /ERC 中转硫和谷胱甘肽合成的酶调节因子基因表达存在差异。与 CN 相比，AD 组海马 /ERC 区 CTH 和 GSS 基因表达降低。
3. 多胺的合成与分解代谢在 ITG 中的 AD 中观察到较高浓度的亚精胺（P=0.004)。与 CN 相比，多胺分解代谢基因 SAT1 和 SMOX 表达增加，而多胺合成基因 SRM 和 ODC1 在海马 / ERC 中表达降低。
4. 尿素循环 在 ITG 中，AD 中的 NAG(P<0.001*) 浓度较低。与 CN 相比，基因 ARG2，ASL，ASS1，OAT 和 ODC1 在 AD 的海马 / ERC 中表达减少。
5. 谷氨酸 - 天冬氨酸代谢 在 ITG 中，AD 中的 NAA (P=0.002*) 浓度较低。与 CN 相比，AD 的 FH，MDH1，MDH2，GLS2 和 GOT2 基因在海马 / ERC 中的表达降低。
6. 神经递质代谢 ITG 中，AD 中的 GABA(P<0.001*) 浓度较低。与 CN 相比，AD 中海马 / ERC 中 GABA 合成基因 SAT1 和 MAOB 的表达增加，而 GLS2 和 OAT 基因的表达降低。
图 5 通过整合了六类生化反应的代谢物和基因表达结果，显示了这些途径如何在多个水平上交叉和潜在地相互作用，以影响 AD 病理和症状的严重程度。
图 5 与转甲基化和多胺合成 / 分解代谢相关的代谢途径中代谢物浓度和基因表达变化的综合总结
总结与局限性
本研究是利用 CE-MS 在脑组织样本中应用靶向代谢组学结合基因表达分析来识别与 AD 的转甲基化和多胺途径相关的多个代谢网络中的异常的研究。由于 ERC 和 HIP 组织样本的可获得性有限，代谢组学分析只能在基因表达与 ERC 和 HIP 相关的 ITG、MFG 和 CB 中进行的，具有一定的局限性，但是，结合代谢组学和转录组分析来绘制先验特定的生化途径，可能会为 AD 如何广泛影响多条相互关联的代谢途径提供重要的见解。虽然样本量较少，研究可能无法将结果外推到更大的人群，显著的结果可能不能反映真正的效果，所以研究者用感兴趣的代谢物指定了先验假设，并实施了 FDR 和 Bonferroni 调整来控制多重比较，以减少潜在的偏差，值得考虑的是，在基于尸检的神经退行性疾病（如 AD) 的评估中，一些观察到的变化可能是与神经元丢失相关的终末事件的非特异性标志物。本研究发现的特异性值得在未来的研究中在其他神经退行性疾病中进行测试。细胞甲基化潜在的改变和转甲基化途径通量的增加，对抗氧化防御机制的需求增加，尿素循环和天冬氨酸 - 谷氨酸途径的代谢紊乱，扰乱了线粒体生物能，增加了多胺的生物合成和分解，以及神经递质代谢的异常，这与 AD 的病理严重程度和临床症状的表现有关。它们说明了 AD 的轮廓是一种普遍存在的代谢紊乱，可能涉及多条相互关联的代谢途径的失调，每条代谢途径都能够触发 AD 病理的积累和症状的演变。这项研究大大增加了对 AD 发病的代谢基础的全面理解，并为疾病调整治疗的新靶点提供了新视角。
参考文献 Uma V. Mahajan, Vijay R. Varma,et al. Dysregulation of multiple metabolic networks related to brain transmethylation and polyamine pathways in Alzheimer disease: A targeted metabolomic and transcriptomic study. PLoS Med.2020; 17(1):e1003012. Epub2020/01/14
https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003012 PMID: 31978055
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