来自基因组和转录变异的时空异质性被发现有助于异柠檬酸脱氢酶-1野生型胶质母细胞瘤(GBM)复发前和复发后的亚型转换。利用5-氨基乙酰丙酸(5ALA)的荧光引导神经外科切除术可以术中显示磁共振成像增强区域外的浸润性肿瘤。促进5ALA代谢为荧光活性PpIX的肿瘤细胞群和功能状态尚不清楚。5ALA代谢(5ALA +)细胞与术后残留病变的空间接近性使得5ALA +生物学成为GBM复发的早期先验指标，但目前对其了解甚少。

对IDH-wtGBM患者(N = 10)未分类的Core、Rim、侵袭性边缘组织和FACE分离的侵袭性边缘5ALA + /5ALA−细胞进行了空间分辨体RNA谱分析(SPRP)，并结合组织学、放射学和双光子激发荧光显微镜分析。分别使用CIBERSORTx和UCell富集算法对SPRP进行反卷积和功能分析。通过分析独立IDH-wt GBM队列(N = 16)的空间转录组学，我们进一步研究了5ALA +富集区域的空间结构。最后，使用Cox比例风险模型对大型GBM队列进行了生存分析。

结合单细胞和空间转录组的SPRP分析发现GBM分子亚型异质性可能以细胞类型特异性的方式表现。感染型5ALA+细胞群具有转录一致的GBM和髓系细胞，具有间充质亚型、伤口反应活跃和糖酵解代谢特征，位于侵袭性边缘，与肿瘤核心不同。PpIX荧光可以单独用来切除肿瘤核心以外的免疫反应区。最后，5ALA+基因与GBM的低生存率和复发率相关，表明该转变从原发性到复发性GBM不是离散的，而是一个连续体，即原发性膨胀的5ALA+残余肿瘤细胞更接近于最终复发的GBM。

IHC、RNA-seq、scRNA‑seq、ST

1. 在空间上不同的GBM区域中癌症特异性和代谢特征的差异调节

分析了10例接受5ALA指导手术的GBM患者的组织样本(代表空间不同的区域(核心、边缘、浸润边缘))中SPRP衍生的RNA-seq数据。对代表性患者(N = 2)的苏木精染色和伊红染色图像进行组织学分析，揭示了5ALA +浸润边缘的细胞和解剖学特征。对于28例患者，虚线边界划分了核心和内缘之间的边界。在大脑新皮层内观察到单个肿瘤细胞，神经元正态分布。细胞肿瘤边缘外微血管增生，反映肿瘤释放并渗透到肿瘤边缘以外的营养因子。对于患者37，在大脑新皮层内观察到侵袭边缘内的单个肿瘤细胞，白质血呈正态分布。低密度肿瘤细胞弥漫性浸润深部白质。此外，在这一深层白质区域内观察到少突胶质细胞、巨噬细胞和星形胶质细胞。

此外，影像学和双光子激发荧光显微镜分析结果显示，另一名术前接受5ALA +治疗的GBM患者的核心和浸润边缘(Inv)在空间上具有不同的性质。与Inv边缘相比，5ALA诱导的PpIX荧光在核心中占优势。在Inv边缘，在正常脑细胞的背景下可以看到间歇性的PpIX荧光。这些结果证明了Inv与先前报道的增强区(ER)和增强边缘(EM)在空间上的不同。使用DEA来探索5ALA +细胞与Core、Rim、侵袭性切缘和5ALA−细胞之间的差异调控基因。然后进行通路富集分析，5ALA +细胞中NFкB和炎症反应通路中TNF-α信号的上调。为了确定癌症相关和代谢途径，在特定区域/分选细胞和所有其他区域/分选细胞之间进行配对设计的基因集富集分析(GSEA)。Core显示出最多的富集通路，包括上皮-间质转化(EMT)和缺氧。与核心相似，EMT和缺氧在边缘高度富集。Core也富含促增殖通路，而Inv中仅富含有丝分裂-纺锤体。对来自GBM患者(N = 36)的组织切片进行Ki-67免疫组化(IHC)，显示在核心浅层内侧区域有大量增殖细胞，其次是前内侧区域和边缘区域。与核心相比，浸润边缘显示出较少的增殖细胞。在核心区有更多的促增殖通路，这与在该区域观察到的增殖细胞数量增加是一致的。除了核心和边缘没有氧化磷酸化外，糖酵解途径的富集可能是由这些区域的缺氧条件诱导的。相比之下，未分选的浸润缘、5ALA +和5ALA分选的细胞均不富集缺氧。侵袭边缘和5ALA−细胞中氧化磷酸化的富集进一步证实了GBM浸润边缘代表一个正常微环境的证据。CD31免疫组化也通过显示Core和Rim高度血管化来强化这一发现，而侵袭边缘观察到低血管化。与先前的DEA结果一致，通过NFкB和炎症反应途径的TNF-α信号在5ALA +细胞以及Core和Rim中高度富集。

2. 5ALA + GBM人群富含间充质亚型、炎症伤口反应转录程序和糖酵解代谢状态

为了验证5ALA +细胞群类似于特定GBM亚型的假设，利用富集分析来鉴定先前由Verhaak等人描述的GBM分子亚型(经典(CL)、神经(NE)、原膜(PN)和间质(MES)。与其他区域相比，核心和边缘区域主要富集CL和PN亚型，特别是5ALA +细胞，而最近修订的非肿瘤性NE亚型在侵袭性边缘区域高度富集。5ALA−细胞主要与NE和PN亚型相关，相比之下，与所有其他区域相比，5ALA +细胞高度且独特地富集了MES亚型，特别是5ALA−细胞。

对来自GBM患者(N = 36)的组织进行免疫组化，以测定NeuN的表达，NeuN代表侵袭性边缘神经元细胞相对于Core和Rim的比例。与浸润性边缘相比，核心区紧随Rim区神经元细胞比例最低。在侵袭边缘观察到的神经元比例最高，进一步证实了空间分子特征。对显著调控的前沿基因进行分层聚类分析显示，相对于5ALA +细胞，CL-和PN特异性基因在Core、Rim和侵袭性切缘中高表达，而NE特异性基因在侵袭性切缘中表达最高。3例患者MES基因表达相对较低，7例患者MES基因表达相对较高。这一结果表明5ALA +人群中存在患者特异性MES基因表达变异性。GSEA显示了这些转录和代谢状态的双重富集，其中发育状态和GPM状态在核心和Rim中富集，与所有其他区域相比，只有发育程序在侵袭性边缘中富集。Te MTC状态在5ALA−细胞中富集；GPM在5ALA+细胞中富集，表明5ALA+和5ALA−细胞不同，尽管膨胀边缘微环境和ALA−细胞的代谢状态不同。伤口反应在5ALA+细胞中唯一富集。对于5ALA+细胞，GPM的富集评分最高，其次是Inf。这些结果强调了在空间上不同的GBM区域和5ALA-ssort细胞中差异转录和代谢状态的激活。5ALA +细胞可能会保持类似于Core的GPM状态。

3. 5ALA +群体代表转录一致的侵袭性恶性细胞和髓系细胞，具有活跃的间充质亚型和炎症伤口反应程序

为了验证恶性GBM细胞可以获得类似髓细胞的转录状态的假设，首先通过tSNE分析GBM图中的恶性和髓系细胞，然后进行Louvain聚类。CNV分析发现了一组独特的非整倍体细胞，仅根据转录特征就被注释为髓系细胞。剩余的髓系细胞主要是二倍体。对非整倍体和二倍体骨髓细胞(N = 132,654)进行了Louvain聚类的tSNE，得到了18个cluster。进行了Fisher精确检验，观察非整倍体和二倍体细胞在cluster中的分布，并确定在特定簇中非整倍体细胞的过度代表。结果显示，C8非整倍体细胞高度富集。通过计算Ucell评分来评估5ALA +基因标记的富集程度，并随后将5ALA + Ucell评分映射到两个髓系细胞群上：髓系非整倍体(MLA)细胞(N = 5171)和二倍体髓样(DM) (N = 127,483)细胞。

MLA细胞在GPM、MES和tnf - α基因特征方面显示出更高的UCell评分。MLA和DM细胞与非髓样恶性细胞相比，都显示出较高的UCell评分。MLA细胞中5ALA +和相关基因特征的高富集表明，尽管这种非整倍体群体在转录上与髓系细胞相似，但可能有助于5ALA +细胞群体的恶性效力。从GBmap数据集建立了一个矩阵，随后使用CIBERSORTx算法从空间分辨的Core和基于5ALA的分类样本(5ALA +和5ALA-)中反卷积转录组。通过CIBERSORTx对分数的估计显示，与Core和5ALA -人群相比，5ALA +人群的MLA分数确实更高。

总的来说，这些数据证实了MES细胞状态、活跃的inf伤口反应转录程序和GPM代谢状态在5ALA +细胞中占主导地位。此外，5ALA +细胞可能在分散的病灶内保持缺氧依赖的GPM状态，尽管在正常的侵袭性边缘微环境中，MTC代谢状态占主导地位。

5. 5ALA +细胞群类似于表达CD44的癌间充质细胞

5ALA +细胞中gsc衍生的inf伤口反应程序的激活提高了保留干细胞样转录组景观的可能性。通过基于5ALA +、5ALA−细胞和空间上不同的GBM区域的大量mRNA表达(SPRP)数据估计患者特异性干性指数(mRNAsi)来找出5ALA +细胞中的干细胞转录组特征。具有最高的干性指数，5ALA +细胞相对于所有未分类的肿瘤区域表现出明显的特征，其中5ALA +细胞与核心和边缘区域相比表现出明显更高的干性特征。将TCGA-GBM样本(代表肿瘤核心)分层为分子亚型，结果显示，与5ALA +和5ALA -细胞相比，GBM亚型的mRNAsi较低。利用了来自代表5ALA -细胞的TCGA邻近非肿瘤组织(NAT)的mRNAsi数据，并将其与代表肿瘤核心的TCGA-GBM组织进行了比较。Bootstrap之后的Wilcox测试显示，与GBM核心相比，NAT区域的mRNAsi值显著更高。认识到5ALA +细胞的独特性，进行了干性与5ALA +特征基因之间的相关性分析。只有23个基因与mRNAsi呈显著正相关，其他基因(N = 228)与mRNAsi呈显著负相关。尽管5ALA +群体表现出较高的干性指数，但由于干性相关基因与5ALA +基因标记之间缺乏显著的相关性，使得5ALA +细胞的干性特征无法确定。

基于Couturier等人的scRNA-seq数据集的tSNE图，tSNE分析显示，富含5ALA +基因标记的细胞与GP和OLC的定位明显，但与包括截断的放射状胶质细胞和癌症间质细胞在内的混合群体存在显著重叠。5ALA +可能类似于癌症间充质细胞，而不是截短的放射状胶质细胞，但也表明5ALA +细胞群中的细胞异质性。

6. 空间解析转录组学揭示了微环境中存在罕见的浸润性5ALA +细胞

进一步利用空间分辨转录组学(stRNA-seq)对来自独立IDH-wt GBM患者队列(N = 16)的组织切片进行分析，研究了容纳这些细胞的空间定位和周围微环境。选择ukf# 334作为具有代表性的组织样本，说明5ALA +转录特征的共定位，具有MES和伤口反应基因特征。此外，5ALA +富集的细胞在空间上接近GPM代谢状态富集的区域和缺氧激活区域。GPM的空间共定位与缺氧密切相关，这为5ALA +细胞活跃的GPM状态作为对代谢改变环境的补偿机制提供了合理的解释。与之前的研究结果一致，5ALA +细胞进一步表现为CD44的高表达。通过空间聚类分析转录异质性揭示了不同聚类的存在(N = 11)。C9和C7主要与5ALA +富集区存在空间重叠，这表明在5ALA +细胞群体中存在异质性转录组景观。5ALA- inv和5ALA- ct在5ALA +和伤口反应基因特征中均富集，而5ALA- inv在MES中富集，进一步证明5ALA +侵袭性边缘细胞可能经历向MES亚型的过渡。

为了更深入地了解5ALA +细胞相对于坏死肿瘤核心的定位和空间微环境的差异，进一步利用stRNA-seq数据在特定组织样本中鉴定5ALA +基因特征富集区域。选择了ukf# 313样本，它代表一个坏死的肿瘤核心，周围是假乳头状细胞，然后是一个CT区域。CNV的推断提供了进一步的证据，表明CT中7号染色体的增加和10号染色体的缺失。GSEA分析显示，细胞区域富含5ALA +基因标记的斑点在空间上远离坏死核心。在样本ukf# 269中，组织学分析显示了CT和空间相邻的NT区域之间的区别。CT和NT之间的空间边界也得到了CNV分析的支持，其中CT的特征是7号染色体的增加和10号染色体的缺失。stRNA-seq分析揭示了CD44表达罕见的5ALA+细胞的存在周围缺氧微管，远离坏死核心，与髓系细胞共同定位。

6. 5ALA +细胞富集的细胞、转录和代谢状态与肿瘤复发有关

与复发肿瘤相比，TCGA原发肿瘤中没有富集基因特征，为了进一步研究独特的5ALA +基因特征对复发和原发GBM患者生存的影响，分别对复发和原发肿瘤进行了单样本GSEA (ssGSEA)，以获得5ALA +基因特征。结合NES计算每个肿瘤样本的5ALA +基因联合标记评分，并与复发患者和原发患者的生存数据进行相关性分析。对于GLASS的复发肿瘤队列，5ALA +基因标记评分与生存率呈显著负相关，而原发肿瘤则没有。多因素回归分析显示，5ALA +基因联合标记与复发性GBM患者的较差生存率显著相关。检索了来自PDEs的原发细胞(N = 10,905)和复发细胞(N = 8833)的scRNA-seq数据。tSNE分析结合Louvain聚类，然后将5ALA + UCell评分映射到tSNE图上，结果表明，在由GBM患者的原发性和复发性肿瘤细胞组成的不同聚类中，5ALA +基因特征明显可见。对比分析证实了之前的假设，即复发性GBM细胞的5ALA + UCell评分明显高于原发细，进一步强调了5ALA +基因标记与GBM复发之间的关联。

综上所述，5ALA +细胞的富集基因特征与GBM的低生存率和复发相关，这表明这些特征在肿瘤进展和疾病复发间隔中可能具有功能影响。

参考文献：

Andrieux, G., Das, T., Griffin, M. et al. Spatially resolved transcriptomic profiles reveal unique defining molecular features of infiltrative 5ALA-metabolizing cells associated with glioblastoma recurrence. Genome Med 15, 48 (2023). https://doi.org/10.1186/s13073-023-01207-1IF: 12.3 Q1