对于非小细胞肺癌（NSCLC），新辅助免疫治疗正在成为一种很有前景的治疗方案 。其疗效的一个常见衡量标准是“主要病理反应”(MPR)，其定义为治疗后常规苏木精和伊红 (H&E) 染色残留的活肿瘤细胞不超过 10% 。肿瘤微环境 (TME) 在肿瘤的发生、发展、转移和耐药性中起着重要作用 。免疫疗法重塑 TME，而 TME 又会影响对免疫疗法的反应。为了探索 PD-1 阻断联合化疗后免疫治疗耐药的机制及其与 TME 变化的关系，将来自3名治疗前和12名接受新辅助PD-1阻断联合化疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的92,000个单细胞的转录组。根据病理反应将12个治疗后样本分为两组：主要病理反应（MPR;n = 4）和非MPR（NMPR;n = 8）来探究TME的变化。

scRNAseq、bulk RNAseq 、非靶代谢

1. PD1阻断联合化疗期间NSCLC的scRNA-seq分析

经过一系列质控后获得92,330个细胞，共26个细胞亚群最后注释为下图中的11个常见的亚群。MPR患者的T细胞，NK细胞和B细胞的比例增加，IHC染色证实MPR样品中T（CD3+）和B（CD20+）细胞的丰度增加，NK（CD56+）增加了一点但无显著性差异。

2. pCR患者联合治疗后正常肺上皮细胞增加及残留癌细胞检测

上皮细胞重聚类为10个亚群，拷贝数变异分析分离恶性和正常细胞。黑色虚线内的细胞群是拷贝数变异的恶性细胞。发现治疗后alveolar cells (E5_SFTPA2), club cells (E8_SCGB1A1), and ciliated cells (E9_TPPP3)表达增加，特别是MPR患者。这表明联合治疗在消除恶性细胞后促进了正常上皮细胞的扩增，正常的上皮细胞可能有助于在先前的肿瘤床中重建正常的肺结构。

3. 恶性细胞的不同分子特征区分了 MPR 和 NMPR

在对TN、MPR 和 NMPR 患者进行差异分析 ，来自MPR患者的恶性细胞高度表达CX3CL1，CD74和MHC-II。响应治疗表达CX3CL1的癌细胞可以促进免疫细胞浸润到TME中，从而提高总生存率。CD74和MHC-II基因是肿瘤抗原呈递所必需的。与TN和MPR患者相比NMPR患者的恶性细胞中的雌激素反应途径上调，非靶向代谢组学验证了结论。

4. 联合治疗后细胞毒性 T/NK 细胞扩增和抑制性 Treg 减少的程度与病理反应呈正相关

将 T/NK 细胞重新聚类并鉴定出 14 个细胞群，进一步计算了 TN、MPR 和 NMPR 患者的 CD8+ T 细胞和 NK 细胞的细胞毒性和耗竭基因特征。治疗后细胞毒性和衰竭特征均显着增加（图 3C，3D），NK_FCGR3A 簇最能代表细胞毒性细胞，并且通过 FCGR3A (CD16a)、FGFBP2 和 CX3CR1 的表达与 NK_KLRD1 细胞区分开来（图3B）。考虑到 CX3CL1 在 MPR 患者癌细胞中的表达（图3C），NK_FCGR3A 细胞可能被 CX3CL1 募集到 TME 中。使用 CellPhoneDB 分析表明，癌细胞和 NK_FCGR3A 细胞之间的 CX3CL1-CX3CR1 相互作用在 MPR 患者中显着增强（图3F）。已报道活化的 Tregs 比幼稚 Tregs 具有更强的免疫抑制功能，并且与不良预后相关 。一致的，激活的 Tregs（Treg_CTLA4，表达 TNFRSF4 和 TNFRSF9）在 MPR 患者中减少。相对于 TN 患者，MPR 和 NMPR 患者中幼稚 Tregs（Treg_SELL，表达 SELL 和 LEF1）的比例均有所降低（图 3E）。MPR 患者始终表现出比 NMPR 患者更低的 Treg 衰竭特征（图3G）

5. 联合治疗促进记忆T细胞分化为效应表型

联合治疗后，记忆CD8+T细胞（CD8_IL7R）减少，而效应T细胞增加（图3E）。这表明治疗可能直接诱导记忆 T 细胞活化成细胞毒性表型。使用 Monocle2 进行拟时序分析。检测到的一种转变路径是从 Tem (CD8_GZMK) 到 Trm (CD8_GZMB) 再到 Tex 细胞 (CD8_HAVCR2；图 3H)。该路径证实了 TME 中 CD8+ T 细胞的连续激活和耗尽。当本研究描绘伪时间中 CD8_IL7R 细胞的分布时，注意到 CD8_IL7R 细胞可以分为 2 个阶段（图 3I）。静息期的CD8_IL7R细胞高表达NR4A1-3，而细胞毒相关基因（GZMA、NKG7和CCL5）和MHC-II基因（CD74和HLA-DRA）在激活期上调（图3I）。治疗后激活细胞的比例增加，并且MPR样品中比NMPR样品中更多的CD8_IL7R细胞被激活（图3I）。综合结果表明，治疗可以激活记忆 CD8+T 细胞进入效应表型，并且这种激活在 MPR 患者中最为明显。

6. FCRL4+FCRL5+ 记忆 B 细胞可预测 ICB 的反应并通过激活 CD4+ T 细胞增强免疫治疗

将 B 细胞重新聚类为 7 个亚群(图4A），比较了它们在 TN、MPR 和 NMPR 患者中的细胞类型分数。初始 B 细胞在治疗后增加，而记忆 B 细胞略有减少。尽管联合治疗后记忆 B 细胞总体上减少，但 被定义为“非典型记忆 B 细胞”的FCRL4+FCRL5+ B 细胞 (B4_FCRL4)在 MPR 患者中表现出略微增加的趋势（图 4B）。同样，免疫荧光染色显示 FCRL4+FCRL5+ 细胞在 MPR 中比 NMPR 样本富集得多（图4D）。本研究研究了 FCRL4+FCRL5+ B 细胞的特征是否可以作为免疫治疗的阳性生物标志物。本研究首先在验证队列中评估了 B4_FCRL4 基因特征，这些结果表明 FCRL4+FCRL5+ B 细胞的特征可用作预测 ICB 反应的生物标志物。

7. CX3CL1招募巡逻单核细胞能预测免疫治疗反应

TME中的骨髓成分表现出显着的异质性，因此根据典型标记基因分为11个簇，包括2个单核细胞亚型、6个巨噬细胞亚型和3个DC亚型（图5A），TCGA-LUAD患者CFP的表达与细胞凋亡特征显著相关，MPR患者Mono_CX3CR1细胞CFP表达显著高于TN和NMPR患者。

验证队列中的MPR患者和来自两个独立黑色素瘤队列的应答者中观察到更高的Mono_CX3CR1特征。在黑色素瘤数据集2中，较高的Mono_CX3CR1特征与较好的生存率有关。MPR患者的Mono_CX3CR1细胞和癌细胞之间的CX3CL1-CX3CR1对显著富集，表明癌细胞中的CX3CL1表达在MPR患者中吸引Mono_CX3CR1单核细胞。

8. 联合治疗对巨噬细胞的影响

Macro_FABP4细胞是组织驻留的肺泡巨噬细胞（AM），治疗后患者的AM显著升高Macro_FABP4，特别是MPR患者。巨噬细胞传统上分为三种亚型：M0（非极化或中性），M1（促炎或抗肿瘤）或M2（抗炎或促肿瘤），计算了M0，M1和M2特征评分，AM表现出类似M0的表型。免疫治疗后，巨噬细胞的M1特征通常预计在应答者中增加，M2特征通常预计在应答者中减少。但MPR中M1特征和M1样亚群（Macro_CXCL9）在治疗后下降，M0特征增加。这些分析表明，联合治疗诱导组织再生巨噬细胞的扩增，并将 TAM 重编程为MPR患者中的中性而不是抗肿瘤表型，但仅在MPR患者中抑制免疫抑制功能。同时树突状细胞通过治疗被激活并在MPR患者中扩增。

9. MPR 患者衰老的中性粒细胞减少，并通过 CCL3 和 CCL4 募集 SPP1+ TAM

研究者探索了在治疗期间重编程中性粒细胞亚群的机制。分析预测 SPP1、IFNγ 和 IL1B 配体驱动衰老 Neu_CCL3 细胞的特定表型(图7G)和 IFNα 配体驱动老化 Neu_IFIT3 细胞的表型。SPP1 是 Macro_SPP1 巨噬细胞的关键标记，SPP1-CD44 和 IL1B-ADRB2 对在两种细胞类型中显着富集（图 7H）。据报道，CD44 调节中性粒细胞吞噬作用和 IL-8 的产生，ADRB2（β2-肾上腺素能受体）的激活可能导致中性粒细胞释放促炎性 S100A8/A9。Neu_CCL3 特征与 TCGA-LUAD 患者中的 Macro_SPP1 特征显着相关（图 7I）。这些表明 Macro_SPP1 巨噬细胞参与了衰老 Neu_CCL3 中性粒细胞的产生，而衰老 Neu_CCL3 中性粒细胞反过来又募集了 Macro_SPP1 巨噬细胞（图 7J）。缺乏 Neu_CCL3-Macro_SPP1 相互作用可能导致 MPR 患者中 Macro_SPP1 巨噬细胞和 Neu_CCL3 中性粒细胞减少（图6A和图7F）。

NSCLC 的 scRNA-seq 分析揭示了新辅助 ICB 联合化疗前后 TME 的动态以及良好反应者和不良反应者之间的不同 TME 特性。研究者在 TME 中鉴定了血清雌二醇和两种细胞类型（FCRL4+ FCRL5+ 记忆 B 细胞和 CD16+CX3CR1+ 单核细胞），它们可以作为治疗反应的生物标志物。此外，研究者的研究捕获了高比例的中性粒细胞，揭示了免疫治疗期间的巨大异质性。

参考文献：

Hu J, Zhang L, Xia H, Yan Y, Zhu X, Sun F, Sun L, Li S, Li D, Wang J, Han Y, Zhang J, Bian D, Yu H, Chen Y, Fan P, Ma Q, Jiang G, Wang C, Zhang P. Tumor microenvironment remodeling after neoadjuvant immunotherapy in non-small cell lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing. Genome Med. 2023 Mar 3;15(1):14. doi: 10.1186/s13073-023-01164-9. PMID: 36869384; PMCID: PMC9985263.