大约50%的局部晚期头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者在接受最终治疗后复发。手

术前给予PD-1免疫治疗可在肿瘤微环境（TME）内产生实质性的病理性肿瘤反应（pTR）。然而，抗肿瘤T细胞在新辅助PD-1阻断作用下的作用机制仍未得到解决，并且缺乏增加病理反应的方法。在一项2期试验（NCT02296684）中，发现45%接受两剂帕博利珠单抗新辅助治疗的患者出现显著的pTRs（≥50%）。对包括6例匹配的新辅助治疗前后在内的共14例肿瘤活检组织的17158个CD8+ T细胞进行单细胞分析。结果显示，在基线TME范围内，应答肿瘤具有克隆扩增的肿瘤特异性耗竭CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），具有组织驻留记忆程序，其特征是高细胞毒性（CTX+）和ZNF683表达。PD-1阻断5周后的病理反应与先前存在的CTX+ ZNF683+ CD8+ TILs的激活一致，与活肿瘤和相关肿瘤抗原的丢失平行。反应与大量CD103+ PD-1+ CD8+ T细胞浸润预处理病变有关，而未耗竭的持续克隆的恢复和克隆替代则是适度的。相比之下，无应答基线TME表现出ZNF683+ CTX+ TILs的相对缺失和随后高度耗竭克隆的积累。在HNSCC中，先前存在的ZNF683+ CTX+ TILs的恢复是新辅助治疗后立即出现反应的主要机制。

单细胞转录组学测序；单细胞TCR免疫组库测序

1. 延长新辅助抗PD-1治疗后的反应

30名III/IV期HNSCC患者在手术前5周接受帕博利珠单抗新辅助治疗（图1A）。29例接受手术切除的双剂量患者的1年无复发率为92.6%。两年总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）分别为92.44% 和88.7% （图1B）。pTR对PD-1阻断的评估基于肿瘤细胞比例的组织学减少（肿瘤坏死程度），并伴有巨细胞/组织细胞反应、角化碎片和纤维化（图1C）。在两剂帕博利珠单抗新辅助治疗和/或延长治疗期（5周vs 2 - 3周）后，观察到pTR类别的分布与先前报道的单剂帕博利珠单抗新辅助治疗后pTR分布相比，pTR-2的权重更高（分别为45% vs 22%;P = 0.085;图1D）

2. HNSCC中的TILs具有细胞毒性和耗竭的特征

为了揭示新辅助PD-1阻断治疗后与pTR相关的T细胞特征，通过5’单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）分析了PD-1阻断前后收集的14个肿瘤活检中分离的CD45+ CD3+ TILs。样本分别来自7名接受两剂新辅助抗PD-1治疗和1名接受一剂抗PD-1的HNSCC患者 （图2A）。在过滤T细胞以表达CD8转录本（见材料和方法）后，获得了17,158个CD8+ TILs，可以分配到12个转录定义的簇中（图2B）。在进一步检查这些集群后，注意到最丰富的终端耗竭（TTE）细胞亚群可以分为两个子集。第一种以极度耗竭（“TTE-EEx”）为特征（图2，C和D）。与效应样激活一致，TTE-CTX表现出上调人类白细胞抗原（HLA）II类基因。相反，TTE-EEX的基因程序由PRDM1的表达主导，PRDM1与TOX一起与最高水平的耗竭相关（图2、C和D）。这种状态伴随着TNFRSF4、TNFRSF9、ICOS和IL2RA的表达增加，所有这些已知在TCR刺激下会急剧上调。在TME中获得这两种不同的表型表明这两组T细胞识别不同的抗原靶点，为了支持这一点，TNExM簇在T细胞的特征中富集，并报道了体外验证的病毒抗原特异性，而TEx簇与实验证实的肿瘤反应性TILs的报道谱显示出强烈的转录相似性（图2E）。

3. 与PD-1阻断反应相关的HNSCC-TILs不同的预处理细胞状态谱

在单剂量帕博利珠单抗研究中，发现CD8+ T细胞浸润与pTR相关，Rs预处理TME中CD8+ TEx-TILs的频率高于NRs（P < 0.0001；图3A），其中大部分可归因于TTE-CTX亚群（13.4倍差异，P = 0.0102；图3B），与NRs相比，来自Rs的预处理CD8+ TEx细胞的细胞毒性基因（PRF-1、IFNG、GZMA、GZMB、GZMH和GNLY）、效应物样激活标记物（如HLA II类转录物上调）和与TRM程序维持相关的基因（ZNF683+）的表达丰富（图3C）。这种来自Rs的CD8+ TEx细胞的高功能进一步得到了先前报道的与高效应功能（即干扰素反应和TCR信号传导升高）相关的基因特征的观察富集的支持（图3D），接受双剂量帕博利珠单抗治疗的17例患者的多重免疫荧光（IF）预处理活检证实，Rs（与NRs相比）更高度浸润CD3+ CD8+ TILs （P = 0.0274;图3,E和F），并且这些细胞共表达PD-1和整合素CD103，这是鉴定具有TRM表型的TILs的成熟的表面标记谱（P = 0.0592;图3,E和F）。

4. 新辅助抗PD-1后TIL细胞状态的动态变化

为了评估PD-1阻断对CD8+和CD4+ TILs整体表型的影响，比较了六组配对的活检前后的TILs，免疫位点阻断启动5周后，3个Rs一致表现出CD8+ TEx细胞的相对收缩（P = 0.0181），被CD8+ TNExM细胞的增加所抵消（P = 0.0008;图4A）。治疗后，CD8+ TEx-TILs的整体特征是细胞毒性基因和TRM （GZMA、IFNG和ZNF683）基因的表达降低;图4 B)。与此相一致的是，应答病变的TEx室内的相对收缩大部分源于CD8+ TTE -CTX TILs的减少（P = 0.0095;图4C）。因此，在基线时高度富集R - TILs的相同种群受PD-1阻断的影响最大，这支持了TTE-CTX在维持生产性pTRs中的主要作用。相比之下，浸润无反应病变的推定肿瘤反应性CD8+ TEx细胞保持严重耗竭状态，并表现出增加的增殖评分，这与治疗后TME中TTE - EEX的积累一致（图4、B和C）。为了证实这些发现，分析了治疗后TILs中预测反应或无反应的基线基因特征。从Rs和NRs中收集的TEx-TILs谱在很大程度上保持不同，并保持基线时鉴定基因特征的富集（图4D）。

治疗结果似乎在很大程度上取决于肿瘤内T细胞区预先存在的状态，Rs在给药前CD8+ TEx TILs的比例更高，细胞毒性电位升高（图5A）。这种定性差异与Rs中TRM-like CD103+ PD-1+ CD8+ T细胞浸润预处理HNSCC活检的数量显著增加有关（P = 0.0186;图5B），特别是在出现更强反应的患者中（pTR-2 vs pTR-0: P = 0.0089;图5B），新辅助治疗后，TRM-like CD8+ TILs的瘤内密度略有增加，但即使在治疗后时间点，Rs仍高于NRs（图5C），证明TTE - EEX的相对收缩不影响治疗后浸润HNSCC病变的CD8+ T细胞的绝对数量。与这些观察结果一致，作为独立验证，先前报道的单剂量新辅助抗PD-1临床试验(3) 中26例患者的基线大量RNA-seq分析证实，Rs中CD8+浸润比NR中更多（P = 0.0342;图5D）。pTR-1和pTR-2患者ZNF683和CTX基因（TTECTX的特征）的基线表达丰富（图5D）。对11例接受三剂新辅助nivolumab治疗的患者（30例）的可获得的大肿瘤RNA-seq数据的外部数据集的分析进一步证实，ZNF683+ CTX+特征在高度缓解的患者中富集（P = 0.0357;图5 E）。在处理后的样本中没有观察到这种差异（图5、D和E）。总之，这些研究表明，高水平的预先存在的耗尽/细胞毒性TIL支持高病理反应（pTR-2），其频率在CD8+ T细胞室内表现出动态变化，同时消除同源肿瘤抗原。

5. TCR克隆型丰富度与PD-1阻断反应相关

使用scTCR-seq分析，随后评估了个体肿瘤内TCR克隆型与治疗前后匹配活检中TNexM或TEx表型的动态关系。这些发现揭示了两个反应组扩增特异性的定性差异：Rs显示大多数预处理CD8+ TEx TILs具有高度扩增的克隆型，主要是TTE-CTX表型，而Rs具有相当少的扩增CD8+ TEx TCR克隆型，优先表现为TTE-EEx表型（图6,A和B）。相比之下，CD8+ T NexMTCRs的主要TEM表型在所有患者中都相似（图6B）。相比之下，在抗PD-1治疗后，在基线检测到的许多克隆型持续存在，在治疗前和治疗后的活检中，占CD8+ TILs的约60%至70%和CD4+ TILs的约15%至40%，与NRs相比，Rs显示来自预处理时间点（预先存在）的持续CD8+或CD4+克隆的比例更大（P = 0.0414和P = 0.0234）;图6C）。通过大量靶向TCR-β链测序，在治疗前和治疗后肿瘤活检中鉴定出的持续克隆构成了TILs的最大部分，在内部和外部队列中，这些持续存在的T细胞克隆也更加扩大，特别是在Rs的基线活检中（图6D）。分析TCR克隆型家族的细胞状态的能力允许进一步研究具有不同表型的克隆的丰富度，抗PD-1治疗后，持续扩增的CD8+ TEx克隆在治疗后特异性收缩（P = 0.0152;图6、E、F），突出了假定的肿瘤反应性预先存在的CD8+ TEx克隆是PD-1阻断后有效反应的主要决定因素。

6. 持续存在的TCR克隆表型的维持强调了先前存在的ZNF683+ CTX+ TEX克隆型在治疗反应中的影响

在所有丢失的、新的或持续存在的TNexM或TEx TCR克隆型中（图7A，左）发现假定的肿瘤反应性TEx TCR克隆型表现出与治疗反应相关的大部分差异。相比之下，在治疗前和治疗后时间点持续存在的NRs CD8+ TEx克隆高度富集与缺乏反应相关的特征（NR - Pre- TEx和“耗竭”基因;图7A，左），来自这些患者的扩增克隆表现出最高水平的耗竭，在PD-1阻断后保持不变（图7A，右）。在跟踪这T细胞群的动态后，观察到它们在基线R TIL中平均占CD8+ TEx TCR的55%（范围，39%至69%）（图7，D和E），平均占总CD8+ TILs的32%（范围，22%至40%）（图7F）。

参考文献：

[1] Oliveira G, Egloff A M, Afeyan A B, et al. Preexisting tumor-resident T cells with cytotoxic potential associate with response to neoadjuvant anti–PD-1 in head and neck cancer[J]. Science immunology, 2023, 8(87): eadf4968.