mRNA-seq项目文章 | EIF3f通过增强结直肠癌去泛素化活性介导SGOC通路重编程

2. EIF3f参与缓解在CRC、泛素化和降解中过度表达的PHGDH

研究人员通过TCGACOAD数据库与另外CRC数据集(TCGA-Coad、GSE9348和GSE41258)中的正常组织相比，发现PHGDH在结直肠癌组织中高表达(fig 2A)，并通过PLA试验(fig 2B)、co-IP(fig 2C)和免疫荧光分析证实了eIF3f-PHGDH的直接结合。eIF3f KD导致PHGDH的稳态表达减少(fig 2D)，但是可被蛋白酶体抑制剂MG132抑制(fig 2E)。此外，eIF3f KD加速PHGDH蛋白质周转(fig 2F)，导致PHGDH的多泛素化水平增加(fig 2G)，而eIF3f的异位表达导致PHGDH的稳定表达增加(fig 2H)，PHGDH的多泛素化水平降低(fig 2I)，并呈剂量依赖关系。另外，eIF3f 减少WT-Ubi 或 K48 Ubi 连接的 PHGDH 的泛素化，但无法减少K63 Ubi连接的 PHGDH（fig 2J），表明 eIF3f 介导的 PHGDH 去泛素化是 K48 连接。ΔMPN或 ΔN的 eIF3f 减弱了其降低 PHGDH 泛素化的能力，表明这些结构域参与了 DUB 活性（fig 2K）。为了进一步了解 MPN 结构域在去泛素化 PHGDH 中的机制，研究人员通过突变 CSN6 和 eIF3f 之间保守的残基构建了 eIF3f 的几个 MPN 突变体(fig 2L)。免疫印迹显示 MPN-KKV 突变体 (KKV→AAA) 损害了其在 PHGDH 泛素化中的 DUB 活性。因此，KKV 残基对于去泛素化 PHGDH 至关重要（fig 2L）。

3. GSK3β介导PHGDH磷酸化从而增强FBXW7β对PHGDH泛素化的调节

研究人员在Ubi-browser网站上找PHGDH的潜在E3连接酶，结合潜在E3连接酶对PHGDH稳态调节的数据挖掘和免疫印迹结果发现FBXW7β可能是PHGDH的潜在E3连接酶（fig 3A）。事实上，FBXW7β异位表达降低了蛋白质的PHGDH稳态表达（fig 3B），但不降低mRNA。co-IP研究表明PHGDH与FBXW7β的相互作用（fig 3C），而FBXW7β介导的PHGDH表达减少可以被MG132抑制，这表明FBXW7β可以通过蛋白酶体调节PHGDH（fig 3D）。事实上，FBXW7β增加了PHGDH的泛素化（fig 3E）。此外，凝胶过滤研究表明，eIF3f 与 FBXW7β和PHGDH形成复合物（fig 3F），表明其在调节FBXW7β和PHGDH中的作用。研究人员检查了表达 sh-NC和sh-eIF3f的CRC细胞的凝胶过滤色谱级分，发现与sh-NC细胞提取物相比，sh-eIF3f 提取物具有更少的PHGDH和更多的FBXW7β（fig 3F）。免疫印迹显示，FBXW7β的过度表达增加了PHGDH的泛素化水平，并且这种效应在eIF3f存在的情况下可以逆转（fig 3G）。FBXW7β通过保守的CPD基序的存在来识别其底物，以便泛素化以进一步蛋白酶体降解（fig 3H）。值得注意的是，已知FBXW7泛素化蛋白的蛋白序列比对分析表明PHGDH在Ser179/Ser183、Thr213/Ser217、Ser349/Thr353、Ser379 和 Thr497/Ser501处具有潜在的磷酸化位点，与CPD基序匹配（fig 3H）。接下来，研究人员构建了PHGDH的预测潜在功能突变体，发现PHGDH Mut（T497A/S501A对FBXW7β的下调具有抵抗力（fig 3I），FBXW7β增加WT PHGDH的泛素化，但未能调节PHGDH Mut（T497A/S501A）泛素化（fig 3J）。此外，FBXW7β加速了WT PHGDH的周转率，但对PHGDH MUT(T497A/S501A)周转率影响不大（fig 3K）。

紧接着，鉴定GSK3β是否是PHGDH的重要磷酸化激酶。由于EGF可以灭活GSK3， EGF治疗和GSK3抑制剂治疗都会导致PHGDH增加（fig 3L），而CHIR治疗可拮抗FBXW7β介导的PHGDFH下调(fig 3M)。Co-IP结果发现PHGDH与GSK3β相互作用（fig 3N），表明PHGDH可能受到GSK3β的调节。事实上，PHGDH稳态表达随着GSK3β量的增加而降低（fig 3O）。研究人员进一步证实野生型GSK3β，而非激酶死亡突变体(GSK3β-Κ85A)，显着增加 PHGDH 磷酸化（fig 3P）。此外，证实只有野生型GSK3β可以增加PHGDH的泛素化(图 3Q）。

5. EIF3f基因敲低抑制结直肠癌细胞丝氨酸合成途径及体内肿瘤生长

本研究中的数据表明eIF3f正向调节PHGDH的表达，从而影响SGOC通路。事实上，eIF3f KD表现出生长抑制，而补充丝氨酸可以抑制eIF3f KD引起的细胞活力下降(fig 5A)。研究人员发现eIF3f KD细胞的SAM水平和NADPH/NADP+比值降低(fig 5B)。此外，进行了[U-13C]-葡萄糖示踪实验，检测SSP途径相关代谢物是否通过eIF3f-PHGDH轴发生变化，eIF3f KD可以减少丝氨酸和甘氨酸的含量，而异位表达的PHGDH可以部分逆转eIF3f KD的这种现象(fig 5C)。为了进一步探讨eIF3f在结直肠癌细胞中的致瘤能力，进行异种移植模型实验结果表明用多西环素诱导sH-eIF3f，eIF3f的敲除抑制了体内肿瘤的生长(fig 5D)。免疫组织化学和免疫印迹显示，eIF3f KD的肿瘤细胞增殖标记物Ki-67显著降低，PHGDH、PSPH、PSAT1和MYC表达降低(fig 5E)。基于免疫组织化学染色，人类结直肠癌组织芯片分析显示eIF3f的表达与PHGDH的表达呈正相关(fig 5F)。总之，这些结果证实了eIF3f的致癌作用，eIF3f通过调节PHGDH的表达而通过SGOC途径重新编程促进了结直肠癌的进展。

6. Wnt信号转录上调eIF3f的表达

研究人员利用JASPAR网站发现EIF3F,启动子区域发现了多个转录因子TCF7L2（或TCF4）的潜在结合位点，表明EIF3F可能是转录因子受Wnt信号通路调控。鉴于Wnt信号在CRC进展中高度激活，进一步用Wnt信号抑制剂NCB0846处理CRC细胞，免疫印迹和qRT-PCR结果显示NCB0846处理以剂量依赖性方式降低eIF3f表达（fig 6A-B）。同样，Wnt-3A激活Wnt信号通路促进了eIF3f表达（fig 6C-D)。此外，Wnt信号传导介质β-catenin/TCF4的表达确实上调了eIF3f基因表达（fig 6E-F）。通过详细搜索TCF4共有序列，鉴定了包含位于-886和-481之间的TCF4结合位点的EIF3F启动子（fig 6G）。EIF3F 启动子区域与荧光素酶报告基因连接，发现 TCF4 过表达上调了 EIF3F 荧光素酶报告基因的活性（fig 6H）。TCF4 ChIP分析表明，TCF4 与 EIF3F 启动子上的 TCF4 结合基序（−494 至 -481）结合，而其他结合位点不受影响（fig 6I）。此外，因为 ChIP 检测显示 TCF4 和β-catenin均与其结合，研究人员将 EIF3F 启动子上的−494CACAGCTGCG-484基序确定为β-catenin/TCF4(fig 6J)。这些数据表明EIF3F是通过β-catenin/TCF4与EIF3F启动子结合而成为Wnt通路的转录靶点。

7. NCT503和LGK-974联合治疗通过抑制Wnt-eIF3f-PHGDH信号轴而更有效地抑制高eIF3f 的PDX肿瘤生长

为了验证研究结果与人结直肠癌的相关性，研究人员进行了细胞生长研究，结果表明NCT-503和LGK-974(Wnt抑制剂)都可以抑制结直肠癌病灶的形成。NCT-503和LGK-974联合应用在抑制结直肠癌病灶形成方面比单独使用NCT-503或LGK-974更有效(fig 7A)。紧接着，建立了PDX模型，用于检测联合治疗对两个结直肠癌PDX组(eIF3f高和eIF3f低)的药物疗效，并用免疫印迹法检测eIF3f的表达水平(fig 7B)。虽然这些药物对 eIF3f 低表达 PDX 肿瘤的疗效在肿瘤体积和重量方面受到损害，但在eIF3f高表达的PDX肿瘤中，NCT-503和LGK-974联合使用在抑制肿瘤生长方面比单独使用NCT-503或LGK-974更有效（fig 7A-D），显著降低Ki67的表达，增加TUNEL信号(fig 7E-H)。总之，靶向Wnt信号和PHGDH活性可能被考虑作为eIF3f高结直肠癌患者的治疗策略。

参考文献:

Pan Q, Yu F, Jin H, Zhang P, Huang X, Peng J, Xie X, Li X, Ma N, Wei Y, Wen W, Zhang J, Zhang B, Yu H, Xiao Y, Liu RY, Liu Q, Meng X, Lee MH. eIF3f Mediates SGOC Pathway Reprogramming by Enhancing Deubiquitinating Activity in Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2023 Sep;10(27):e2300759. doi: 10.1002/advs.202300759. Epub 2023 Aug 6. PMID: 37544925; PMCID: PMC10520677.