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宏基因组-微生物16S/18S/ITS等扩增子测序

微生物16S/18S/ITS等扩增子测序简介

16S rDNA 扩增子测序:16S rDNA为原核生物中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,具有9个高变区域(V1-V9)和10个保守区域,其中保守区反映细菌种属间亲缘关系,高变区反映了物种间的特异性,选择通用引物进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对16S rDNA的单个或多个高变区进行测序,来分析环境或者临床样本中古菌或细菌的群落结构多样性。 18S rDNA扩增子测序:18S rDNA真核生物中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,具有可变区(V1-V9,没有V6区)和保守区。保守区反映生物物种间的亲缘关系,高变区反映物种间的差异。选择通用引物进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对18S rDNA的高变区(一般选择V4区)进行测序,来分析环境或者临床样本中真核生物群落结构多样性。 ITS扩增子测序:ITS分为两个区域:ITS1/ITS2,其中ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间,ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。通过新一代测序技术对ITS1或者ITS2进行测序,进一步做环境微生物中真菌多样性分析。

 

伯豪特色

  1. 先进的测序平台:Illumina PE250/300 高通量测序平台可供选择,根据检测目的提供不同的解决方案;
  2. 项目经验丰富:可提供肠道、水体、土壤、组织液等多种样本类型的微生物多样性与环境、农林及医疗等多领域的分析服务;
  3. 专业全面的服务:经验丰富的技术团队可提供专业的方案设计、检测报告解读、文章写作建议等;
  4. 个性化服务:针对VIP客户的个性化分析需求,提供专业全面的检测服务。提供专业的实验指导和定制高级分析。

 

实验流程

 

分析流程

 

方案策略

 

测序平台

Miseq

 

样本要求

环境及临床样本(干冰或冰袋运送)

  1. 土壤≥ 3 g(污染土壤样本要适当增加送样量);粪便≥ 2 g;
  2. 水体样本:滤膜(0.22 µm滤膜) ≥ 2个;拭子样本≥ 2个;

DNA/PCR产物(干冰或冰袋运送)

  1. DNA:浓度≥ 20 ng/μL;总量≥ 400 ng;DNA要有明显主带,无降解;OD260/280= 1.8-2.0
  2. PCR 产物:浓度≥ 20 ng/μL,总量≥ 400 ng,片段大小< 450 bp,条带单一,无降解,无引物二聚体

 

部分类似结果展示

 

案例解析

案例一:乙酸盐有利于好氧颗粒污泥对发酵液中磷的富集
微生物的厌氧消化(Anaerobic digestion,AD)是一种有效的,而且被广泛运用在能源和资源恢复中的生物技术。厌氧消化产生的污水以及发酵产生的发酵液中含有许多的对环境有害的有机质物质,比如易挥发的脂肪酸和矿物质元素(氮和磷),由于这些有机质物质不能被很好的处理,进而对我们的环境造成了严重的污染。本研究通过使用两个相同批次的反应器Ra和Rp,分别使用乙酸和丙酸作为额外添加碳源,来培养好氧颗粒进而去除发酵液中的磷。同时,作者通过二代测序的方法对两个反应器中的微生物多样性进行检测。结果显示,Ra反应器中的好氧颗粒具有较高的磷去除能力。微生物多样性检测结果发现,Ra反应器中拟杆菌(34%)和beta变形菌门的含量较多,推测拟杆菌(34%)和beta变形菌门可能是造成高效去除磷能力的主要原因。

原文出处:Cai W, Huang W, Li H, et al. Acetate favors more phosphorus accumulation into aerobic granular sludge than propionate during the treatment of synthetic fermentation liquor. Bioresource technology, 2016, 214: 596-603. IF= 4.494.

 

案例二:肠芽囊原虫可以增加人类肠道细菌微生物的多样性
本文通过二代测序平台Ion Torrent对48个肠道定植有牙囊原虫的病人的粪便样本以及48个正常人的粪便样本进行16S rDNA的V3-V5区进行测序,结果表明定植有牙囊原虫的病人的肠道细菌多样性比健康人的丰富,其中梭状芽胞杆菌比较丰富,而肠杆菌相对要少。这个结果表明,肠道中定植有牙囊原虫可以营造一个健康的肠道微生物多样性,而不会造成肠道微生物多样性的失衡。

原文出处:Audebert C, Even G, Cian A, et al. Colonization with the enteric protozoa Blastocystis is associated with increased diversity of human gut bacterial microbiota. Scientific reports, 2016, 6. IF= 5.578.

 

案例三:产道液体擦拭婴儿身体可以部分恢复剖腹产婴儿的微生物多样性
剖腹产婴儿从母体获得微生物的种类与自然分娩婴儿从母体获得的微生物的种类有很大的差别,这些微生物种类的差异回来代谢紊乱和免疫紊乱的风险,因此如何避免剖腹产造成的婴儿微生物种类变化变得十分重要,本研究用母体产道液体来对剖腹产婴儿进行擦拭,30天后通过16S rDNA测序技术对剖腹产婴儿的皮肤,口腔和肠道进行微生物的多样性检测,发现用产道液体擦拭的剖腹产婴儿的微生物多样性与自然分娩婴儿的微生物多样性相似。同时也证明了,剖腹产婴儿肠道,皮肤和口腔微生物只能部分通过从母体获得。

原文出处:Dominguez-Bello M G, De Jesus-Laboy K M, Shen N, et al. Partial restoration of the microbiota of cesarean-born infants via vaginal microbial transfer. Nature medicine, 2016. IF= 27.363.

 

常见问题

1、一个OTU(Operational Taxonomic Units)就是一个物种吗?OTU是指在群体研究中为了便于分析,人为给定的一个分类单元,理论上一个OTU代表一个物种,也有可能几个OTU都注释到同样的物种。

 

2、微生物组学研究中生物学重复设置几个比较合适呢?为了保证研究结果的可靠性,需要设置生物学重复。一般类型的样本(土壤,水体等)需要3个以上生物学重复;临床样本(拭子,粪便,唾液等)通常需要10个以上甚至几百个生物学重复;模式动物样本(小鼠,大鼠等)需要8个以上。为了保证理想的实验结果,建议老师在经费允许的情况下,尽可能的选择更多的样本来进行实验。

 

3、环境微生物多样性测序可以鉴定到物种的种水平吗?
分析结果中物种的注释结果取决于数据库中的注释,一般16S rDNA扩增子测序可以分类到属水平,现有的文章中也大多会讨论到属水平。这主要因为16S rDNA序列在某些物种间的差别非常非常小,同时测序本身也存在一定的错误率,如果强行分类到种水平,会浪费很多reads,鉴定的结果可靠性也会降低,不能客观反映样本本来的微生物组成情况。而宏基因组测序可以通过比对marker进行的方式将物种鉴定到种甚至菌株的水平。